癌鈣調(diào)蛋白-魚精蛋白截短體融合蛋白的基因構(gòu)建與表達(dá).pdf

1、背景：
　　癌鈣調(diào)蛋白(omcomodulin,OM)是二十世紀(jì)七十年代末Macmanus從大鼠肝癌組織中提取出的一種小分子蛋白，有研究表明OM有促進(jìn)神經(jīng)生長的作用，并且有加大神經(jīng)生長因子促進(jìn)視神經(jīng)生長的作用。
　　目的：
　　體外拼裝癌鈣調(diào)蛋白(OM)/魚精蛋白截短體（tp）融合基因,將其克隆至原核表達(dá)載體pET22b,并在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)癌鈣調(diào)蛋白/魚精蛋白截短體融合蛋白。
　　方法：
　　從

2、大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中提取細(xì)胞的總RNA，設(shè)計引物擴增癌鈣調(diào)蛋白基因，并在其3’端引入魚精蛋白截短體（tp）的編碼基因，經(jīng)PCR擴增獲得OM/tp融合基因，將目的基因克隆至中間載體PUC57中,提取質(zhì)粒PUC57-OM/tp,并測序鑒定。將克隆后的基因亞克隆至原核表達(dá)載體pET22b中,提取質(zhì)粒PET22b-OM/tp,測序鑒定。質(zhì)粒構(gòu)建成功后，在大腸桿菌BL21中化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過SDS-PAGE及Western-blot驗證。<

3、br>　　結(jié)果：
　　瓊脂糖凝膠電泳獲得目的基因（OM/tp），大小與預(yù)期的目的基因大小一致，目的基因克隆后，菌檢PCR獲得長度在500bp左右的陽性克隆,與預(yù)期大小一致。抽提質(zhì)粒酶切后與載體PET22b連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a，菌檢PCR獲得長度在500bp左右OM/tp的陽性克隆，與預(yù)期大小一致。抽提質(zhì)粒PET22b-OM/tp,經(jīng)測序后與預(yù)期的序列一致。不同濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，細(xì)菌裂解上清中均出現(xiàn)大小約為18