乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白結(jié)合蛋白基因的篩選研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是嚴(yán)重影響我國(guó)人民健康的重要傳染病，可引起急、慢性病毒性肝炎，導(dǎo)致肝纖維化(LC)，甚至肝細(xì)胞癌(HCC)。HBV感染致肝細(xì)胞損傷機(jī)制，很大程度上與病毒蛋白和宿主細(xì)胞蛋白間的相互作用相關(guān)。因此，研究HBV抗原成分與宿主細(xì)胞蛋白相互作用及其機(jī)理能在一定程度上對(duì)HBV的致病機(jī)制做出解釋?zhuān)瑸閷ふ矣行Х乐蜨BV的方法提供新線索。 HBV基因組具有4個(gè)主要的開(kāi)放讀碼框架(ORF

2、)，分別命名為S、C、P、X區(qū)，其中S區(qū)通過(guò)三個(gè)框架(in-frame)內(nèi)起始密碼子(ATG)分為三個(gè)結(jié)構(gòu)域：前-S1，前-S2和S結(jié)構(gòu)域，由此3個(gè)ATG開(kāi)始編碼產(chǎn)生3種大小不同的表面抗原蛋白：主蛋白(SHBs)，中蛋白(MHBs：前-S2+S)和大蛋白(LHBs：前-S1+前-S2+S)。完整的MHBs多肽鏈?zhǔn)怯?5個(gè)aa的PreS2區(qū)和226個(gè)aa的S區(qū)組成的，研究表明，羧基末端截短形式的HBV表面抗原中蛋白(MHBs<'t>)具有

3、反式調(diào)節(jié)功能，在HBV致病(癌)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，但MHBs<'t>與宿主細(xì)胞的結(jié)合蛋白目前還不十分清楚。 為研究羧基末端截短形式的HBV表面抗原中蛋白的結(jié)合蛋白，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選表達(dá)型cDNA白細(xì)胞文庫(kù)中與MHBs<'t>的結(jié)合蛋白的基因。酵母雙雜交是一種研究蛋白．蛋白間相互作用的比較快速、可靠并可大規(guī)模篩選的技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)采用酵母雙雜交系統(tǒng)-3，利用兩種單倍體酵母a和α接合型可以配合形成二倍體，而其中表達(dá)的外

4、源蛋白仍能相互作用，免去了低效率文庫(kù)質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的問(wèn)題，大大提高了雜交效率：在原技術(shù)基礎(chǔ)上增加了3個(gè)報(bào)告基因，降低了假陽(yáng)性率，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真陽(yáng)性率達(dá)95％。我們首先利用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)方法擴(kuò)增羧基末端167位aa截短的HBV表面抗原中蛋白的基因編碼序列，經(jīng)酶切鑒定正確并連接入酵母表達(dá)載體pGBKT7中構(gòu)建“誘餌”質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞AHl09(a型)并在其內(nèi)表達(dá)，Western-blotting驗(yàn)證。然后與轉(zhuǎn)化了人白細(xì)胞c

5、DNA文庫(kù)質(zhì)粒pACT2的酵母細(xì)胞Y187(α型)進(jìn)行配合。 結(jié)果成功克隆出MHBs<'t>蛋白并在酵母細(xì)胞中表達(dá)，配合后選出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培養(yǎng)基又能在鋪有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并變成藍(lán)色的菌落10個(gè)。提取陽(yáng)性酵母菌落的質(zhì)粒，電穿孔法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，接種在氨芐青霉素-LB平板上選擇并測(cè)序，經(jīng)生物信息學(xué)分析，排除讀碼框架不正確者，最后得到9種已知基因，ADP核糖基因子

6、2個(gè)，RAB6相互作用蛋白1個(gè)，CCR4-NOT轉(zhuǎn)錄復(fù)合體亞基10(CCR4-NOT-10)1個(gè)，脂多糖蛋白結(jié)合蛋白(LBP)1個(gè)，醛縮酶B(AI．,DOB)1個(gè)，補(bǔ)體成分3(C3)1個(gè)，丙酮酸脫氫酶(PDH)1個(gè)，人類(lèi)細(xì)菌人工染色體(BAC)1個(gè)。 為進(jìn)一步確證經(jīng)酵母雙雜交技術(shù)篩選出的結(jié)合蛋白與誘餌蛋白間在體外也有相互作用，我們擴(kuò)增出脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)基因并克隆入酵母表達(dá)載體pGADT7，在TNT網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物體外翻譯