非活動性乙型肝炎表面抗原攜帶者的病毒學特征.pdf

1、根據(jù)2006年全國范圍內(nèi)的血清流行病學調(diào)查資料，我國1～59歲人群中乙型肝炎表面抗原（hepatitis Bsurfaceantigen，HBsAg）攜帶率已從1992年的9.75%降至7.18%，盡管HBsAg攜帶率降到8%以下，但由于我國人口基數(shù)龐大，按目前HBsAg攜帶率推算，我國仍然有HBsAg攜帶者約9300萬人，約占全世界慢性HBV感染者的1/4。其中慢性乙型肝炎（chronichepatitis B，CHB）約為2000萬

2、～3000萬例，全國每年死于乙肝相關(guān)肝病約30余萬例。所以對慢性HBV感染者特別是對處于非活動性HBsAg攜帶者（inactive HBsAg carrier，HBsAg-IaC）狀態(tài)的感染者的管理是一項重要而艱巨的任務(wù)。 HBV感染者可以打破免疫耐受清除乙型肝炎病毒e抗原（hepatitisBeantigen，HBeAg），產(chǎn)生乙型肝炎病毒e抗體（hepatitisBeantibody，anti-Hbe），即發(fā)生HBeAg血清

3、學轉(zhuǎn)換，發(fā)生HBeAg血清學轉(zhuǎn)換的群體中有67%-80%的人可以保持低水平的HBVDNA或HBVDNA檢測不到、ALT水平正常和輕度或不伴有肝組織壞死性炎癥的狀態(tài)，這種被狀態(tài)定義為HBsAg-IaC狀態(tài)。HBsAg-IaC狀態(tài)可以是自發(fā)病情緩解而達到，也可以是核苷（酸）類似物（NA）或α干擾素抗病毒治療達到完全應(yīng)答后病情得以緩解和穩(wěn)定而達到，不管HBsAg-IaC狀態(tài)經(jīng)歷何種過程預(yù)后通常較好，是HBV感染者比較理想的維持狀態(tài)。

4、然而，即使長期保持穩(wěn)定攜帶狀態(tài)，由于肝細胞核內(nèi)的共價閉合環(huán)狀DNA（covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA）很難被徹底清除，所以當機體處于免疫虛損或免疫抑制狀態(tài)時或在病毒變異的情況下，病毒就會重新活動、復制，肝組織內(nèi)再次出現(xiàn)炎癥活動。曾有研究報道超過20%的HBsAg-IaCs進展為HBeAg陰性CHB[HBeAgnegativechronichepatitisB，HBeAg（-）CHB]，而后者存在肝臟疾

5、病反復活動、進展、發(fā)生肝硬化和肝細胞癌的風險，約有23%和4%的HBeAg（-）CHB分別進展為肝硬化和肝癌。為了阻止HBsAg-IaCs向HBeAg（-）CHB發(fā)展的進程，首先弄清HBsAg-IaCs和HBeAg（-）CHB宿主和病毒學特征有無差異是很重要的。利用NA對HBeAg陽性慢性乙型肝炎[Hbe Agpositivechronichepatitis B，HBeAg（+）CHB]進行抗病毒治療，在藥物和機體免疫力的共同作用下HB

6、V水平逐漸降低、HBeAg逐漸被清除，其中有相當一部分人可以達到HBsAg-IaC狀態(tài)，HBeAg（+）CHB經(jīng)NA治療達到完全應(yīng)答的患者（NCR-e+CHB）可以實現(xiàn)并藥物維持HBsAg-IaC狀態(tài)，與自發(fā)形成HBsAg-IaC狀態(tài)的過程不同，為了發(fā)現(xiàn)NA抗病毒治療的療效與宿主和病毒的關(guān)系，認識兩組人群的基本特征和各自的病毒學特點也很重要。就以上兩個問題我們進行了以下兩項臨床研究： 一.非活動性HBsAg攜帶者與HBeAg陰性

7、慢性乙型肝炎患者病毒學特征的比較 1.1研究目的：為了探索HBsAg-IaCs向HBeAg（-）CHB進展的危險因素，對自然轉(zhuǎn)歸的HBsAg-IaCs和HBeAg（-）CHB兩組人群的HBV基因型、PC的G1896和BCP的A1762/G1764變異等病毒學特征分別進行比較。 1.2研究方法：按照2005年《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標準，進行HBsAg-IaCs和HBeAg（-）CHB患者的血清收集。采用QIAgenb

8、loodDNA檢測試劑盒（Qiagen，德國）分別對187例HBsAg-IaCs血清、99例HBeAg（-）CHB血清進行HBVDNA提取，然后利用半巢式PCR進行CX片段（nt1643-nt1974）擴增，半巢式PCR的第一輪引物分別為P9和P35，第二輪引物為P9和CSP，用CSP引物作測序引物，使用ABI3730測序儀（Appliedbiosystems，美國）直接測序。HBV基因組第1762A/1764T以及第1896G核苷酸變

9、異的判斷采用ClusterⅩ進行序列排列和人工確認。基因型判斷采用PCR-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法，用PCR-RFLP方法判定不出基因型的標本采用直接測序方法判斷（同研究二中基因型確定的方法）。 1.3研究結(jié)果：187例HBsAg-IaCs組中113例HBsAg-IaCs血清HBVDNA經(jīng)PCR擴增陽性，其中103份完成CX片段（nt1643-nt1974）測序，HBeAg（-）CHB組中99份血清全部HBV

10、DNAPC擴增陽性，全部完成CX片段（nt1643-nt1974）測序。HBsAg-IaCs組中HBV基因B型比例高于HBeAg（-）CHB組（84/113vs46/99，74.3%vs46.5%，P=0.000）；HBsAg-IaCs組的G1896A變異比例高于HBeAg（-）CHB組（69/103vs39/99，67.0%vs39.4%，P=0.000），但A1762T/G1764A變異株比例低于后者（38/103vs63/99，3

11、6.9%vs63.6%.P=0.000）。經(jīng)二分類Logistic回歸分析得出男性（OR=7.519，95%CI=2.693-20.995，P=0.000）、年齡超過40歲（OR=25.369，95%CI=5.323-120.913，P=0.000）以及基因C型感染（OR=2.309，95%CI=1.028-5.186，P=0.043）是與HBeAg（-）CHB相關(guān)的危險因素的結(jié)論，并未發(fā)現(xiàn)A1762T/G1764A變異（OR=2.01

12、7，95%CI=0.958-4.247，P=0.065）與G1896A變異（OR=0.565，95%CI=0.265-1.205，P=0.140）有明顯的獨立預(yù)測HBeAg（-）CHB的作用。 1.4研究結(jié)論：HBsAg-IaC在病毒學特征上與HBeAg（-）CHB明顯不同；HBV基因C型（HBV/C）感染、年齡大的男性HBsAg-IaCs相對容易向HBeAg（-）CHB發(fā)展。 二.NA治療HBeAg（+）CHB完全應(yīng)答

13、患者的病毒學特點 2.1研究目的：為了認識NCR-e+CHB和HBsAg-IaC兩組人群HBsAg-IaC狀態(tài)的穩(wěn)定性的差異、影響NA療效的因素，對NCR-e+CHB和HBsAg-IaC兩組人群的宿主基本特征及HBV的基因型、PC的G1896A和BCP的A1762T/G1764A變異等病毒學特征方面進行比較。 2.2研究方法：首先按照2005年《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標準，收集NCR-e+CHB（治療組）和HBsAg

14、-IaCs（對照組）的血清收集。采用QIAgenbloodDNA檢測試劑盒（Qiagen，德國）分別對117例NCR-e+CHB和58例HBsAg-IaCs進行HBVDNA提取，然后以BS1和POL2為外引物、YS1和YS2為內(nèi)引物行巢式PCR對S區(qū)進行擴增，對HBVDNAS區(qū)擴增陽性的標本的PCR產(chǎn)物利用RFLP法進行內(nèi)切酶酶切、電泳、觀察條帶基因分型，基因分型不明確的再進行測序鑒定基因型。再利用巢式PCR對117例NCR-e+CHB

15、和58例HBsAg-IaCs進行PC和BCP區(qū)兩個片段的擴增：以P9、CSP為第一輪引物，再分別以P9、P11和Ce、CSP為第二輪引物，共用第一輪PCR產(chǎn)物進行BCP和PC區(qū)兩個片段的PCR擴增，再利用錯配PCR-RFLP方法對擴增陽性的標本的第二輪PCR產(chǎn)物進行酶切確定變異情況，不能酶切的標本再行研究一所述的半巢式PCR對CX片段（nt1643-nt1974）進行擴增，對CX片段（nt1643-nt1974）陽性的PCR產(chǎn)物進行直接

16、測序，測序結(jié)果采用ClusterX進行序列排列和人工確認以對G1896A和A1762T/G1764A進行檢測。 2.3研究結(jié)果：NCR-e+CHB組男性比例高于HBsAg-IaC組（77.8%vs58.6%，P=0.008），NCR-e+CHB組的平均年齡大于HBsAg-IaC組（t=2.2.67，P=0.025），NCR-e+CHB組中血清HBVDNAS區(qū)擴增陽性率低于HBsAg-IaC組中血清HBVDNAS區(qū)擴增陽性率（52

17、.1%vs79.3%，P=0.001），經(jīng)PCR-RFLP和測序的方法分析得出NCR-e+CHB組中1例A型、44例B型、16例C型，HBsAg-IaC組中33例B型、10例C型、2例D型、1例基因型不明，兩組的主要基因型構(gòu)成比無統(tǒng)計學差異（x2=0.154，P=0.694）；使用酶切和部分PCR產(chǎn)物直接測序的方法總計得出：NCR-e+CHB組BCP區(qū)A1762T/G1764A檢出率顯著低于HBsAg-IaC組（9.8%vs41.4%，