乙型肝炎病毒CD重組體的分布以及臨床和病毒學(xué)特點研究.pdf

1、2002年,西藏地區(qū)乙型肝炎病毒(HBV,HepatitisB)基因型分布的研究首次報道了S區(qū)同源性分析屬于D基因型,而C區(qū)同源性分析為C基因型的毒株。隨后他們對這種毒株進行了HBV全基因序列擴增和測序,在對全基因序列的家系進化和重組分析中發(fā)現(xiàn)這種S區(qū)與C區(qū)分型不一致的毒株是C型HBV在nt51-1450區(qū)段重組了D基因型而出現(xiàn)的結(jié)果,并推測這種特殊的HBV/CD重組體是西藏地區(qū)流行的HBV優(yōu)勢毒株。隨后我室在對全國進行HBVC基因亞型

2、調(diào)查時發(fā)現(xiàn)在甘肅臨夏地區(qū)回族人群中亦有HBV/CD的存在。與前述報道不同的是,我們首次發(fā)現(xiàn)了在S區(qū)nt10-799重組了D基因型的HBV/CD重組體,其中D基因型占整個HBV基因組的25％;只有少數(shù)是與前述西藏地區(qū)相同的HBV/CD重組體,這種重組體的D基因型占整個HBV基因組的46％。在對兩種重組體進行全基因組擴增測序并進行進化樹分析以后,我們發(fā)現(xiàn)以全基因組構(gòu)建的進化樹中,這兩種重組體屬于HBVC基因型的大分支,但構(gòu)成了與C1-C5亞

3、型不同的兩個分支,因此也可以將其命名為C6和C7亞型。由此我們將重組區(qū)段較短的HBV/CD重組體稱為HBV/CD1(C6亞型),而將重組區(qū)段較長的HBV/CD重組體稱為HBV/CD2(C7亞型)。
　　 為了解HBV/CD1和HBV/CD2這兩種重組體的特征,我們首先調(diào)查了HBV/CD重組體在西北五省不同地區(qū)和不同民族中的分布。采用聚合酶鏈反應(yīng)一限制性片斷長度多態(tài)性(PCR-RFLP)法,對來自西北五省份的1000例慢性HBV感

4、染者血清進行了HBV基因分型,同時對部分CD重組體標(biāo)本進行了全基因序列擴增和測序。在西北五省中,西藏地區(qū)和青海省的HBV主要流行株為CD重組體,HBV/CD的感染占到整個HBV感染的64％和55％；甘肅和寧夏兩省的少數(shù)民族地區(qū)則以C型為主要流行株,CD重組體是流行率位于第二位的毒株,在兩省的流行率分別為27％和15％；新疆地區(qū)維族人群以D基因型和C基因型為主要流行株,HBV/CD重組體僅占4％。HBV/CD重組體的分布在不同省份差異有顯

5、著性(x2=296.6,P=0.000)。在調(diào)查的漢、藏、回、維吾爾四個民族中,HBV/CD重組體是藏族人群中的優(yōu)勢基因型,占HBV總感染人群的65％；在回族人群中占30％；在西北地區(qū)藏族和回族聚居地及聚居地附近的漢族人群中占21％；在新疆維吾爾族人群的HBV感染中僅占4％。各民族之間的基因型分布差異有顯著性(x2=118.8,P=0.000)。HBV/CD在西藏,青海,甘肅各地區(qū)不同民族間的分布差異有顯著性(西藏地區(qū)漢族為10％,藏族

6、為79％,x2=83.156P=0.000；青海漢族33％、藏族67％、回族50％,x2=42.043P=0.000,甘肅漢族13％、藏族31％、回族61％,x2=54.409,P=0.000)；在寧夏回族(15％)和甘肅回族(61％)人群中的流行率差異有顯著性(x2=36.555,P=0.000)。HBV/CD1和HBV/CD2的分布在西藏和青海不同地區(qū)差異有顯著性(x2=91.921,P=0.000)。因此認(rèn)為HBV/CD重組體在西

7、北五省不同地區(qū)和不同民族中的分布有特殊的規(guī)律。
　　 為進一步了解HBV/CD重組體與我國西北地區(qū)流行的其他基因型在臨床和病毒學(xué)特征上是否有差別。我們設(shè)計了臨床對照實驗,比較了HBV/CD重組體與西北地區(qū)其它常見基因型B、C、和D在臨床特征方面的差異。同時我們還調(diào)查了C和CD重組體兩種基因型毒株在前C和C區(qū)常見變異位點發(fā)生變異模式的差別。我們對來自西北五個臨床中心的507份慢性HBV感染者標(biāo)本的臨床資料和HBV基因分型結(jié)果進行了

8、統(tǒng)計學(xué)對比分析,同時隨機選取以上臨床中心的標(biāo)本中CD重組體和C基因型共356份慢性HBV感染者血清標(biāo)本進行了前C及C基因區(qū)的序列擴增和分析。結(jié)果顯示四組基因型病例在年齡和性別構(gòu)成比無差異的情況下,各基因型間ALT水平無統(tǒng)計學(xué)差異；TBIL水平在各組之間差異有顯著性(F=3.555,P=0.014),其中CD重組體的TBIL水平最低,平均值為19.3±28.7,而B基因型的TBIL水平最高平均值為46.3±71.9。HBeAg陽性率在各組

9、之間差別也有顯著性(x2=30.422,P=0.000),其中只有CD重組體的HBeAg陽性數(shù)大于陰性數(shù),而其它基因型均為HBeAg陰性數(shù)大于陽性數(shù)。HBVC和CD重組體兩種基因型在前C及C區(qū)常見變異位點發(fā)生變異的模式上前C區(qū)A1896位點的變異(PC變異)在兩種基因型之間的差異存在顯著性(x2=9.525,P=0.002),其中CD重組體PC變異的頻率低于基因型C；同時核心啟動子(BCP)雙變異在兩種基因型間差異也存在顯著性(x2=5

10、.466,P=0.019),其中C基因型BCP變異的頻率低于CD重組體。提示HBV/CD重組體有不同于西北地區(qū)流行的其它基因型毒株的臨床和病毒學(xué)特征。
　　 為進一步探討HBV/CD重組體是否由HBV/C基因型和HBV/D基因型的共同感染和隨后的重組產(chǎn)生,并探明HBV/CD重組體的變異速率。我們收集了三個存在不同HBV基因型混合感染的家庭和一個單純感染了HBV/CD重組體的家庭。對四個家庭各成員的HBV全基因或部分序列進行了克隆

11、和分析,并對測序結(jié)果進行了異質(zhì)性分析和構(gòu)建進化樹。結(jié)果我們應(yīng)用三代成員均有HBV/CD重組體感染的序列計算出HBV/CD重組體的變異率為3.5*10-5每位點每年。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)有不同基因型混合感染者的個體中分離的準(zhǔn)種序列在不同基因型間的序列異質(zhì)性較小,而在同種基因型間的序列異質(zhì)性較大。在采用準(zhǔn)種異質(zhì)性最大的個體nt64-1200所構(gòu)建的進化樹中我們看到基因型C2和CD重組體之間沒有明顯的界限,而且可看到從基因型C到CD重組體的漸變演化過程

12、。這可能提示HBV/CD重組體并非基因型C和基因型D之間重組產(chǎn)生的產(chǎn)物,而只是與基因型C異質(zhì)性較大的準(zhǔn)種株,在某些個體中這種準(zhǔn)種因為更適合于宿主而被選擇成為優(yōu)勢株。
　　 為了解HBV/CD重組體和基因型C、基因型D在體外的復(fù)制特性差別,我們構(gòu)建了HBV/CD重組體和基因型C、基因型D的1.3拷貝HBV,并通過瞬時轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系HepG2,來研究HBV的復(fù)制及蛋白表達(dá)情況。我們構(gòu)建了2株HBV/C基因型、2株HBV/D基因型和3

13、株HBV/CD重組體毒株的1.3拷貝HBV序列,將1.3拷貝HBV全基因序列與PUC19質(zhì)粒相連。經(jīng)測序證實插入序列的正確性后提取質(zhì)粒,用脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,并對轉(zhuǎn)染后72小時的細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞中的HBsAg和HBeAg分別進行了定量檢測。結(jié)果證明轉(zhuǎn)染的1.3拷貝HBV能夠在HepG2細(xì)胞中進行轉(zhuǎn)錄和翻譯,在細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞內(nèi)均可測到HBsAg和HBeAg,為研究CD重組體與基因型C和基因型D在體外的復(fù)制差別搭建了平臺。