甘蔗黃葉病毒外殼蛋白基因克隆分析及原核表達(dá).pdf

1、甘蔗是世界最重要的糖料作物，蔗糖占我國食糖產(chǎn)量的90％以上，同時(shí)它也是南方地區(qū)生產(chǎn)燃料乙醇的最佳可再生能源作物之一。甘蔗黃葉綜合癥(SugarcaneYellowleafSyndrome，SYLS)是世界及我國近年發(fā)現(xiàn)的重要病害，造成產(chǎn)量下降、品質(zhì)變劣和種性退化。現(xiàn)在認(rèn)為，甘蔗黃葉綜合癥是由甘蔗黃葉病毒(SugarcaneYellowLeaffVirus,SCYLV)引起的。 甘蔗黃葉病毒主要危害甘蔗等禾本科作物，是一種由蚜蟲持

2、久性傳播的單鏈正義RNA顆粒病毒，它是黃癥病毒科(Luteoviridae)的一個(gè)新成員。甘蔗黃葉病毒外殼蛋白是和蚜蟲傳播相關(guān)的，并且和病毒自身的許多生命活動(dòng)相關(guān)，研究表明該基因轉(zhuǎn)化植物可提高植物抗病性。由于美國CP系列品種普遍易感該病，CP系列品種是我國主要親本，因此急需提高我國自育品種對(duì)黃葉綜合癥的抗性。為此在國家“十五”948項(xiàng)目：甘蔗良種和技術(shù)引進(jìn)與推廣項(xiàng)目(2003-Q06)支持下，本研究采用同源克隆技術(shù)，分離甘蔗黃葉病毒外殼

3、蛋白基因，并對(duì)其進(jìn)行序列分析，而后通過原核表達(dá)研究該基因所編碼的特異蛋白表達(dá)情況。結(jié)果如下： 1.從田間采集帶有甘蔗黃葉綜合癥的病葉，分離提取其RNA。根據(jù)已發(fā)表的SCYLV的外殼蛋白全序列設(shè)計(jì)特異性引物，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從甘蔗病葉的mRNA擴(kuò)增得到全長約600bp的目的DNA片段。 2.回收并純化該目的片斷，克隆到載體pMD18-T上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株E.coliDH5α中大量繁殖。利用氨芐青霉素篩選抗性菌落，采用

4、PCR和酶切鑒定擬轉(zhuǎn)化子，獲得真是轉(zhuǎn)化子。序列分析表明成功獲得全長SCYLV-CP基因。該基因的開放閱讀框包括591個(gè)核苷酸，編碼196個(gè)氨基酸，與已報(bào)道的SCYLV基因組的核苷酸序列的同源性為97％～99％。 3.用pET29a(+)為載體骨架，構(gòu)建含CP基因的原核表達(dá)載體pET29a-CP，利用卡那霉素和PCR鑒定擬轉(zhuǎn)化子，獲得真實(shí)轉(zhuǎn)化子。 4.利用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。采用HisTrapKit純化目的基因所表