馬鈴薯Y病毒N株系蚜傳相關(guān)蛋白HC-pro基因的克隆及原核表達(dá).pdf

1、植物病毒是一種分子生物,他一般不能在細(xì)胞外獨(dú)自存活,它們?cè)谧匀唤绲膫鞑ナ峭ㄟ^(guò)各種介體昆蟲,線蟲和真菌這些小型細(xì)胞生物完成的,病毒和這些不同的傳播介體之間發(fā)展起多種高效?；缘膫鞫具^(guò)程,使得病毒能夠在自然界存活并傳播擴(kuò)展開來(lái).馬鈴薯Y病毒是馬鈴薯Y病毒屬的成員,能夠被蚜蟲非持久性傳播,主要危害馬鈴薯和煙草,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失.馬鈴薯Y病毒基因組編碼的HC蛋白是和蚜蟲傳播相關(guān)的一個(gè)蛋白因子,并且和病毒自身的許多生命活動(dòng)相關(guān).該試驗(yàn)通過(guò)設(shè)計(jì)特

2、異性引物,利用RT-PCR技術(shù)從陜西獲得馬鈴薯Y病毒N株系分離物中克隆出了HC基因并進(jìn)行原核表達(dá)研究,主要結(jié)果如下:1.分離田間采集的馬鈴薯Y病毒壞死株系,獲得陜西地區(qū)馬鈴薯Y病毒的分離物;以其為材料,接種煙草后,提取病株RNA;優(yōu)化擴(kuò)增體系,RT-PCR反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增獲得大約1.4kb左右的PVY-N的HC-pro基因片斷.2.將HC-pro基因克隆進(jìn)克隆載體pBLueKS中,轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α菌株中大量繁殖.3.用pBV221、pE

3、T30a和pTrcHisA分別構(gòu)建含HC-Pro的原核表達(dá)載體pBVHC、pETHC、pTrcHC.轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21誘導(dǎo)表達(dá)后發(fā)現(xiàn)pBVHC的表達(dá)量最高.4.通過(guò)一系列的梯度試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在不同的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間下,原核表達(dá)載體pBVHC對(duì)HC-pro蛋白的表達(dá)豐度不同,其中,37℃預(yù)培養(yǎng)4小時(shí),42℃熱激培養(yǎng)6小時(shí)后獲得的菌液目標(biāo)蛋白的濃度最適合于純化.5.利用電透析的方法純化回收pBVHC表達(dá)的大量目標(biāo)蛋白,免疫家兔后,采血獲得HC-pr