犬瘟熱病毒H基因克隆測序與原核表達(dá).pdf

1、將犬瘟熱病毒弱毒株接種Vero細(xì)胞觀察細(xì)胞病變，將細(xì)胞反復(fù)凍融三次收獲病毒，并對病毒增殖純化。根據(jù)GenBank中已發(fā)表犬瘟熱病毒Onderstepoort弱毒株的附著或血凝蛋白基因序列，設(shè)計(jì)合成了一對能擴(kuò)增1074bp基因片段的引物，引物兩端有Sal Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位點(diǎn)。以病毒RNA為模板，用RT-PCR方法，擴(kuò)增出1074bp H基因。將擴(kuò)增得到的部分H基因克隆到pMD18-T載體上，經(jīng)藍(lán)白斑和酶切鑒定篩選出陽性克隆進(jìn)行序列測定

2、，用blast工具將其與GeneBank上標(biāo)準(zhǔn)株代表毒株序列進(jìn)行了比較。結(jié)果表明：該基因與標(biāo)準(zhǔn)株代表毒株序列完全同源，同時與疫苗株Onderstepoort、Convac 株和國內(nèi)外CDV病毒分離株進(jìn)行了序列分析和同源性比較。結(jié)果顯示目前使用的CDV弱毒疫苗株H基因的核苷酸和編碼氨基酸與國內(nèi)和日本犬瘟熱病毒分離株同源性比較低，與揚(yáng)州分離株同源性為90.6％，長春分離株為91.3％，新疆分離株為90.5％，日本分離株D85755為91％；

3、與Onderstepoort、Convac株、美國分離株98-2666-2同源性較高，分別為97.7％、97.2％、98.1％，與國內(nèi)、日本分離株存在明顯的差異。上述結(jié)果表明，CDV在傳代過程中由于受生態(tài)環(huán)境、不同動物之間互相傳播等因素的影響，引起了野毒株的變異，CDV疫苗株不能對所有的CDV流行株產(chǎn)生有效的保護(hù)。 對克隆載體pTH做Sal Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切，將所得片段以正確閱讀框架插入pET-32a(+)載體，構(gòu)建了重組質(zhì)