表達(dá)IL--7的重組犬瘟熱病毒的構(gòu)建與鑒定.pdf

1、犬瘟熱是由副黏病毒科麻疹病毒屬的犬瘟熱病毒(Canine distemper virus，CDV)引起的感染犬和浣熊等食肉動物并呈世界范圍分布的一種傳染病。犬瘟熱具有高度的傳染性，嚴(yán)重影響?zhàn)B犬業(yè)和毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。CDV弱毒活疫苗的廣泛使用大大降低了犬瘟熱的爆發(fā)，但仍有報道在已免疫過的犬中出現(xiàn)CDV的感染。傳統(tǒng)的CDV弱毒活疫苗的免疫效果易受母源抗體的干擾，此外不同易感動物對這些疫苗的敏感性也有差異，可能導(dǎo)致接種動物產(chǎn)生腦炎等不良反

2、應(yīng)。因此，開發(fā)一種安全、高效的CDV疫苗對控制犬瘟熱的流行至關(guān)重要。
　　CDV作為一種不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒，可包裝容納和穩(wěn)定表達(dá)較大片段的外源蛋白的基因，在自然狀況下很少或不發(fā)生基因交換現(xiàn)象，上述生物學(xué)特性提示CDV可作為一個很好的疫苗載體。因此，本研究以實驗室保存的CDV弱毒疫苗株CDV11為親本毒株，構(gòu)建了CDV11全長cDNA感染性克隆pAC-CDV11，并成功拯救出重組犬瘟熱病毒rCDV11，建立了該毒株的反向遺

3、傳操作平臺。rCDV11在Vero細(xì)胞上的感染能力和生長特性與母本病毒株CDV11無顯著差異。為了找到合適的CDV11載體外源基因插入位點，我們將綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)基因插入CDV11基因組不同基因之間的非編碼區(qū)，拯救出各重組犬瘟熱病毒，評估不同位置表達(dá)外源蛋白的能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將GFP基因插入CDV11基因組P-M基因之間非編碼區(qū)的重組犬瘟熱病毒rCDV-P/GFP/M在Vero細(xì)

4、胞上的生長特性與親本株rCDV11相似，能穩(wěn)定、高效的表達(dá)GFP，具有良好的遺傳穩(wěn)定性。結(jié)果表明CDV弱毒疫苗株CDV11具有作為活疫苗載體表達(dá)外源蛋白的潛力，P-M基因之間非編碼區(qū)可作為一個較好的外源基因插入位點。
　　白介素-7(Interleukin-7，IL-7)作為一種細(xì)胞因子，參與調(diào)控淋巴細(xì)胞生長發(fā)育，在多種病毒誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用。接下來，我們構(gòu)建了表達(dá)鼠源IL-7的重組犬瘟熱病毒rCDV-IL7，rC

5、DV-IL7在Vero細(xì)胞中的生長特性與親本株rCDV11無顯著差異，表明IL-7的表達(dá)不影響重組犬瘟熱病毒的復(fù)制和擴散。將rCDV-IL7在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳10代，各代次病毒滴度均介于106.0-106.5TCID50/mL之間，且能穩(wěn)定表達(dá)IL-7，表明重組犬瘟熱病毒rCDV-IL7在Vero細(xì)胞中具有良好的遺傳穩(wěn)定性。酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測結(jié)果表明

6、重組犬瘟熱病毒rCDV-IL7可在Vero細(xì)胞中表達(dá)IL-7且具有劑量依賴性。細(xì)胞活性檢測結(jié)果表明IL-7的表達(dá)對Vero細(xì)胞無明顯毒副作用。
　　為研究重組犬瘟熱病毒對小鼠的致病性，分別將重組病毒rCDV-IL7和rCDV11經(jīng)腦部途徑和肌肉途徑感染小鼠，所有感染重組犬瘟熱病毒的小鼠均未出現(xiàn)犬瘟熱臨床癥狀，與對照組相比，小鼠體重變化均無顯著性差異。結(jié)果表明IL-7的表達(dá)沒有增加rCDV11對小鼠的致病性。
　　為進(jìn)一步研究

7、rCDV-IL7的免疫原性，將重組病毒rCDV-IL7和rCDV11分別按1×105TCID50/100μL/只的劑量，肌肉途徑免疫小鼠，在初次免疫3w后以相同途徑、相同劑量再次免疫小鼠。初次免疫后連續(xù)10w檢測小鼠體內(nèi)CDV中和抗體水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組小鼠在加強免疫后，免疫反應(yīng)迅速增強，與rCDV11相比，rCDV-IL7可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生更高滴度的中和抗體。
　　綜上所述，我們成功建立了CDV弱毒疫苗株CDV11的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，并