犬瘟熱病毒H基因克隆、DNA疫苗構(gòu)建及其免疫效力評(píng)價(jià).pdf

1、犬瘟熱（Canine distemper, CD）是由犬瘟熱病毒（Canine distemper virus, CDV）引起的一種傳染力強(qiáng)、高致死率的多種屬動(dòng)物共患傳染病。犬瘟熱弱毒疫苗的廣泛應(yīng)用顯著降低了犬等肉食動(dòng)物犬瘟熱的暴發(fā)，但犬瘟熱弱毒疫苗株殘余毒力對(duì)野生動(dòng)物致病的病例也時(shí)有報(bào)道。此外，弱毒疫苗的應(yīng)用對(duì)免疫動(dòng)物及野毒感染動(dòng)物的鑒別帶來(lái)較大困難。近年來(lái)，基于CDV主要抗原基因（H、F和N）的DNA疫苗研究取得較大進(jìn)展。血凝素（H

2、）蛋白是CDV囊膜主要成份，其具有較高的基因變異率，同時(shí)也是病毒主要保護(hù)性抗原蛋白，能激發(fā)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗CDV中和抗體和細(xì)胞免疫。此外，CDV核衣殼（N）蛋白特有的細(xì)胞毒性T細(xì)胞表位（CTL）能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫，使這兩種靶基因成為當(dāng)前CDV DNA疫苗研究的熱點(diǎn)。本研究主要包括以下內(nèi)容：
　　1.應(yīng)用RT-PCR方法對(duì)2013~2015年間來(lái)自不同地區(qū)的20份犬、水貂、狐貍和貉源犬瘟熱陽(yáng)性病料中克隆得到CDV H全基因。經(jīng)H

3、基因測(cè)序比對(duì)分析結(jié)果表明：CDV H基因核苷酸與推導(dǎo)氨基酸序列的同源性分別為90.6％~100%和90.5%~100%，與CDV3、Onderstepoort等疫苗株相比，同源性為90.4%~99.9%和89.0%~99.8%。其中5株CDV H蛋白位于SLAM受體結(jié)合區(qū)的第542位氨基酸由I突變?yōu)镹?；贑DV H基因氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的結(jié)果顯示，有1株屬于Amecica-1基因型，其余19株為Asia-1基因型，說(shuō)明Asia-

4、1型是目前CDV的流行型，為下一步DNA疫苗CDV毒株類(lèi)型的選擇提供參考。
　　2.以Asia-1基因型CDV野毒株SD(14)7株 H和N基因作為DNA疫苗靶基因，雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體pIRES為骨架，將野生型H和N基因、密碼子優(yōu)化的H和N基因，以及作為DNA疫苗分子佐劑的水貂IFN-γ基因分別構(gòu)建了6種不同類(lèi)型的DNA疫苗表達(dá)載體；將其命名為 p-H-IRES、p-H-IRES-N、p-H-IRES-IFN p-optiH-IRE

5、S、p-optiH-IRES-optiN和p-optiH-IRES-IFN。通過(guò)間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)（IFA）證實(shí)以上重組質(zhì)粒目的基因在BHK-21細(xì)胞中均能夠正確表達(dá)，經(jīng)密碼子優(yōu)化的H和N基因表達(dá)量明顯升高。
　　3.為了探究克隆有不同基因的重組質(zhì)粒作為DNA疫苗的免疫效力，本試驗(yàn)將p-H-IRES、p-H-IRES-N、p-H-IRES-IFN、p-optiH-IRES、p-optiH-IRES-optiN、p-optiH-IRE

6、S-IFN重組質(zhì)粒和PBS及pIRES空載體對(duì)照組共8組對(duì)8周齡BALB/c小鼠以100μg/只的劑量免疫3次，對(duì)免疫小鼠相應(yīng)細(xì)胞免疫和體液免疫指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，所有免疫組在三免后血清中IFN-γ、IL-2、IL-4、TNF-α細(xì)胞因子均有明顯升高，且高于對(duì)照組；CDV中和抗體滴度在1:24~1:26之間，說(shuō)明6種重組質(zhì)粒均有一定的免疫原性，其中免疫組p-optiH-IRES-IFN質(zhì)粒免疫組在動(dòng)物三免后血清中IFN-γ、IL-2、IL