犬瘟熱病毒LAMP檢測方法建立及其串聯(lián)表位卵黃抗體中和效力初步研究.pdf

1、犬瘟熱(canine distemper，CD)是由犬瘟熱病毒(canine distemper virus，CDV)引起的一種急性高度接觸傳染性病。近年來其自然感染宿主范圍不斷擴(kuò)大，除了犬和毛皮動(dòng)物外，還可以感染獅、虎、靈長類等多種動(dòng)物。已建立犬瘟熱病毒的檢測方法有電子顯微鏡技術(shù)、IFA、ELISA、RT-PCR等，但因耗時(shí)長，操作繁瑣，需要特殊儀器等因素沒能廣泛用于臨床診斷。另外，在一些國家和地區(qū)出現(xiàn)免疫犬感染犬瘟熱的病例報(bào)道，可能

2、是流行毒株與疫苗株不匹配，造成疫苗免疫失敗。卵黃抗體作為一類高效生物制劑在防治動(dòng)物疾病中顯示了明顯的效果，為犬瘟熱防治提供了新的思路。
　　 本研究首先從感染CDV病犬的內(nèi)臟器官分離得到了3株病毒，分別命名為J7、A8、S9。對(duì)CDV H基因擴(kuò)增測序，進(jìn)行了核苷酸、氨基酸同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果表明：3株分離株核苷酸的同源性為99.1～99.3％，分離株與A75/17毒株同源性最高，與疫苗株Onderstepoort、CDV3

3、同源性最低，與臨床常用犬瘟熱疫苗同源性差異較大。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，分離株與5804P、5804株親源關(guān)系較近，而與疫苗株Onderstepoort、CDV3親源關(guān)系最遠(yuǎn)。將分離株與CDV7個(gè)基因型代表進(jìn)行核苷酸同源性分析，與國內(nèi)分離的Asia-1型HLJ3-08同源性最高，為99.2%～99.3%。分離株與Europe型、America-2型、European wildlife型、Asia-2型、Arctic-like型、Vaccin

4、e型同源性逐漸降低，分離株屬于Asia-1型。分離株H基因編碼607個(gè)氨基酸，含有9個(gè)潛在的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)，疫苗株Convac、Onderstepoort的糖基化位點(diǎn)有7個(gè)和4個(gè)，臨床常用犬瘟熱疫苗糖基化位點(diǎn)為6～7個(gè)。
　　 本研究建立了CDV環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測方法。根據(jù)CDV N基因保守序列設(shè)計(jì)合成內(nèi)引物(FIP，BIP)、外引物(F3，B3)。分別進(jìn)行了反應(yīng)條件優(yōu)化、特異性試驗(yàn)、敏感性試驗(yàn)及臨床樣品檢測。結(jié)果

5、顯示，該方法63℃水浴1h即可完成反應(yīng)，可以檢測到最低cDNA的濃度大約為9.6×10-5μg/μL，分別比RT-PCR和CDV膠體金試紙條檢測方法靈敏10和1000倍。同時(shí)對(duì)狂犬病毒(RV)、犬細(xì)小病毒(CPV)、犬腺病毒Ⅱ型(CAVⅡ)、CDV進(jìn)行LAMP方法擴(kuò)增，僅CDV為陽性結(jié)果。用已建立的LAMP方法檢測臨床樣品，檢測結(jié)果與RT-PCR方法符合率為100%，說明本方法特異，靈敏，可用于CDV快速檢測。
　　 本研究利用

6、表位串聯(lián)技術(shù)，采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，獲得CDV F基因B細(xì)胞線性表位重組蛋白。將表位串聯(lián)重組蛋白、CDV-J7株、CDV-11株3種抗原作為免疫原對(duì)7月齡海蘭蛋雞進(jìn)行免疫。共免疫3次，每次間隔2周。串聯(lián)表位重組蛋白組，一免、二免、三免劑量分別為0.4mg/只、0.6mg/只、0.8mg/只；CDV-J7株組，一免、二免、三免劑量均為3.0ml/只(103.5TCID50/ml)；CDV-11株組，一免、二免、三免劑量均為3.0 ml

7、/只(104.5TCID50/ml)。
　　 采用氯仿抽提法提取卵黃抗體，間接ELISA法檢測抗體效價(jià)。3種不同抗原卵黃抗體ELISA效價(jià)最高值分別為1:2048、1:512、1:256。體外中和試驗(yàn)結(jié)果顯示，卵黃抗體原液中和CDV能力較差，隨濃縮倍數(shù)增加(5和10倍)，卵黃抗體中和CDV能力增強(qiáng)，24h內(nèi)對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用，48h細(xì)胞病變開始明顯。未接毒MDCK細(xì)胞生長正常，非免疫卵黃抗體產(chǎn)生細(xì)胞病變，高免卵黃抗體對(duì)細(xì)胞幾乎無損