犬瘟熱病毒南京分離株核蛋白基因的克隆、表達(dá)及其免疫小鼠誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答.pdf

1、犬瘟熱(Canine Distemper，CD)是由犬瘟熱病毒(CDV)感染引起的一種急性、高度接觸性傳染性疾病，是我國(guó)當(dāng)前對(duì)養(yǎng)犬業(yè)、毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)和野生動(dòng)物保護(hù)業(yè)危害最大的疫病之一。常規(guī)弱毒疫苗雖然在CD防控中發(fā)揮了非常重要的作用，但是也存在諸多缺點(diǎn)。為了研究新一代安全、高效的CD基因工程疫苗，本研究對(duì)CDV南京分離株(CDV-NJl5)核衣殼蛋白(N)基因進(jìn)行了克隆、序列分析，分別構(gòu)建了N基因的原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載體，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物

2、的免疫原性進(jìn)行了初步研究，并進(jìn)行了小鼠的DNA免疫試驗(yàn)，測(cè)定重組質(zhì)粒誘導(dǎo)的抗體效價(jià)。 根據(jù)GenBank上發(fā)表的CDV毒株序列設(shè)計(jì)一對(duì)跨越N基因編碼區(qū)的引物，采用RT-PCR方法擴(kuò)增CDV-NJ15 N基因，并將其插入到pMD 18-T 中，構(gòu)建克隆載體pMD-N。經(jīng)序列測(cè)定，克隆的N基因長(zhǎng)1572bp，編碼523個(gè)氨基酸。比較GenBank中收錄的其它CDV毒株序列，發(fā)現(xiàn)它與Onderstepoort疫苗株和Convac疫苗株的核苷

3、酸同源性均為99.7％，氨基酸同源性為99.4％。與其他分離株的核苷酸同源性94.0～95.1％，氨基酸同源性為97.5～98.3％。推測(cè)CDV-NJl5是CDV疫苗株的變異株。以CDV-NJl5為模板，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，分段擴(kuò)增得到了N基因上下游的981bp和702bp兩個(gè)片段，將其分別。T-A克隆到pMD　18-T載體后，再亞克隆到原核表達(dá)載體pET-32a(＋)中，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主菌BL2l中，在37℃1mM IPTG誘導(dǎo)下兩

4、個(gè)片段均獲得良好的表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE鑒定，其表達(dá)的融合蛋白約56.1和44.8kD，與預(yù)期值一致。免疫轉(zhuǎn)印試驗(yàn)顯示，兩個(gè)重組蛋白均可被CDV Onderstepoort株兔抗血清識(shí)別，表明該重組蛋白具備天然N蛋白的部分抗原性。為探索更為敏感的診斷方法和研制CDV新型疫苗創(chuàng)造條件。 對(duì)克隆載體pMD-N進(jìn)行雙酶切，將得到的CDV-NJ15 N基因定向克隆到pcDNA3.1(-)真核表達(dá)載體中，通過(guò)磷酸鈣介導(dǎo)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，用SD

5、S-PAGE和Western-blot分別鑒定表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)分子量及其免疫原性。結(jié)果證明獲得正向插入的pcDNA-N重組表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)分子量約58.2kD，與預(yù)期值大小一致，且該表達(dá)產(chǎn)物能夠被CDV-Onderstepoort株的兔抗血清識(shí)別，表明構(gòu)建的pcDNA-N重組質(zhì)粒能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)并且具有抗原性。以構(gòu)建好的CDV N和H基因真核表達(dá)載體pcDNA-N和pcDNA-H為基因疫苗，分組免疫6周齡昆明系小鼠，以2周為

6、間隔，共免疫4次，最后一次免疫3周后眼眶采血分離血清。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)和病毒中和試驗(yàn)(SN)分析基因免疫在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。結(jié)果顯示pcDiNA-N和pcDNA-H單獨(dú)免疫分別激發(fā)了10<'2.69±0.149>和10<'0.63±0.147>滴度的ELISA抗體，聯(lián)合免疫激發(fā)了10<'2.93±0.165>滴度的ELISA抗體，低于弱毒疫苗產(chǎn)生的抗體滴度(10<'3.35±0.252>)，兩者差異顯著(p<0.05