丙型肝炎病毒F蛋白克隆表達及其免疫反應(yīng)的研究.pdf

1、丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白是近年來報道的HCV core蛋白編碼基因的核糖體讀碼框移蛋白，其功能尚未闡明。為探討機體對F蛋白的免疫應(yīng)答及其臨床意義，我們成功構(gòu)建了重組HCV F蛋白、core蛋白編碼基因的亞克隆，在原核系統(tǒng)中表達了重組HCV1b型F蛋白和core蛋白，用Western Blot方法鑒定其抗原特異性，用純化的重組蛋白和人工合成的F99多肽作為包被抗原，建立了抗F蛋白抗體的ELISA檢測方法。168例丙型肝炎病人血清中抗c

2、ore蛋白抗體、抗F蛋白抗體和抗F99多肽抗體的陽性率分別為95％、68％和36％。抗F蛋白抗體滴度與丙型肝炎病人的基因型、病毒載量和轉(zhuǎn)氨基酶水平并無相關(guān)性。55例經(jīng)干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒有效的病人治療后抗F蛋白抗體滴度明顯下降(P<0.01)，而17例抗病毒無效的病人治療后抗F蛋白抗體滴度治療后無明顯變化，兩組之間有明顯的差異(P<0.05)。相反，本組72例病人抗病毒治療后抗core蛋白抗體滴度并無明顯變化。另外，抗F蛋白抗體陰性

3、的丙型肝炎病人抗病毒治療后獲得病毒學(xué)持續(xù)應(yīng)答(SVR)的比率(15/15，100％100)明顯高于抗F蛋白抗體陽性的病人SVR的比率(70％)(P<0.05)。基于以上研究，我們發(fā)現(xiàn)HCV1b型的F蛋白能產(chǎn)生不同于core蛋白的免疫反應(yīng)，丙型肝炎病人抗F蛋白抗體的滴度與干擾素聯(lián)合利巴韋林治療應(yīng)答密切相關(guān)。 本研究構(gòu)建了F蛋白的重組真核表達載體，體外轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞系，Western blot證實了其特異性表達。用此純化的重組D

4、NA免疫轉(zhuǎn)基因小鼠(HLA-DRB10101和HLA-DPB10401)，用涵蓋整個F蛋白序列的15肽庫篩選CD4+T細(xì)胞表位；同時對47例HCV1b型慢性丙型肝炎病人進行MHC- II類分子限制的基因分型，用篩選得到的F蛋白的表位肽進行體外刺激慢性HCV感染者的PBMCs，用流式細(xì)胞技術(shù)細(xì)胞內(nèi)染色方法檢測能產(chǎn)生IFN-γ的CD4+T細(xì)胞。結(jié)果在轉(zhuǎn)基因小鼠中鑒定了2個HLA-DR和1個HLA-DP限制性的HCV F蛋白的T細(xì)胞表位，并能

5、引起小鼠脾臟細(xì)胞增殖反應(yīng)。用篩選到的HCV F蛋白的表位肽體外刺激HLA-II類分子相匹配的慢性HCV感染者PBMCs后，只能檢測到很小比率CD4+T細(xì)胞能夠產(chǎn)生IFN-γ，與健康對照之間沒有明顯的差別(P>0.05)。因此，HCV1b型F蛋白存在CD4+T細(xì)胞表位，但慢性HCV感染者F蛋白CD4+T細(xì)胞特異性的免疫反應(yīng)比較弱或者缺失。本研究表明：HCV F蛋白能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生特異性的體液免疫應(yīng)答及較弱的CD4+T細(xì)胞免疫應(yīng)答，F(xiàn)蛋白抗體