HIV Vpr通過上調(diào)miR-122表達(dá)促進(jìn)丙型肝炎病毒RNA復(fù)制及其蛋白合成.pdf

1、背景和目的:
　　HIV和HCV因有著共同的傳播途徑，其混合感染在臨床上很常見。大量的研究證實(shí)在HIV/HCV混合感染患者中肝硬化和肝癌的發(fā)生率較HCV單獨(dú)感染患者明顯增高，且混合感染患者生存率降低，流行病學(xué)資料亦證實(shí)HIV/HCV混合感染者血清中HCVRNA載量較HCV單獨(dú)感染者明顯升高，提示HIV促進(jìn)HCV復(fù)制，可能為HIV/HCV混合感染患者中HIV導(dǎo)致HCV肝臟疾病加重的主要原因。但到目前為止HIV/HCV混合感染中HIV

2、影響HCV復(fù)制的具體機(jī)制仍未明確，且此方面的研究甚少，臨床治療措施有限，因此，開展HIV影響HCV復(fù)制分子發(fā)病機(jī)制的研究，一直是國內(nèi)外HIV/HCV混合感染研究領(lǐng)域的亮點(diǎn)，且具有重要的臨床與科學(xué)價(jià)值。HIV蛋白被發(fā)現(xiàn)在HIV影響HCV復(fù)制的過程中扮演著重要角色，而Vpr蛋白作為HIV重要的輔助蛋白之一，通過其介導(dǎo)HIV整合前復(fù)合物(preintegration complex，PIC)的核運(yùn)輸，進(jìn)而促進(jìn)HIV-1感染未分化細(xì)胞;通過誘導(dǎo)

3、細(xì)胞周期停滯在G2分裂期，調(diào)控HIV-1長末端重復(fù)序列(LTR)及宿主基因的轉(zhuǎn)錄激活，并調(diào)節(jié)NF-κB的活性，因而在HIV的持續(xù)感染和致病過程中有著重要作用。在本研究中，我們探討了Vpr對HCV復(fù)制的影響及其調(diào)控機(jī)制，旨在為HIV影響HCV復(fù)制的機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　通過構(gòu)建HCV5'UTR驅(qū)動的熒光素酶報(bào)告基因和miR-122啟動子驅(qū)動的熒光素酶報(bào)告基因，通過使用兩種HCV感染細(xì)胞模型，HCVJFH1感染

4、細(xì)胞模型和OR6細(xì)胞模型，采用熒光定量PCR技術(shù)、免疫蛋白印跡和熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)檢測Vpr對HCVRNA復(fù)制和HCV蛋白表達(dá)的影響。通過雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)檢測Vpr對HCV5'UTR活性的調(diào)控影響。此外，通過雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)和Realtime PCR檢測Vpr對miR-122啟動子活性、precusormiR-122和miR-122 mRNA轉(zhuǎn)錄影響。進(jìn)一步通過使用miR-122抑制劑抑制miR-122的表達(dá)，予以熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)、熒

5、光定量PCR技術(shù)和免疫蛋白印跡檢測miR-122在Vpr上調(diào)HCV5'UTR活性，促進(jìn)HCVRNA復(fù)制和HCV蛋白表達(dá)中的影響。
　　結(jié)果:
　　通過構(gòu)建HCV5'UTR驅(qū)動的熒光素酶報(bào)告基因，我們發(fā)現(xiàn)Vpr可上調(diào)HCV5'UTR的活性，呈劑量依賴性。另外，通過使用Molt-4細(xì)胞和Huh7.5.1細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Vpr可從淋巴細(xì)胞中分泌出來，獨(dú)立進(jìn)入肝細(xì)胞中發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。Vpr在JFH1感染細(xì)胞系統(tǒng)中顯著促進(jìn)HCVR

6、NA的復(fù)制和HCV蛋白的表達(dá);在OR6細(xì)胞中，Vpr同樣可明顯上調(diào)HCV海腎熒光素酶活性，并增強(qiáng)HCV蛋白的表達(dá)。Vpr穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株予以HCVJFH1感染后也證實(shí)Vpr可在JFH1感染后72小時(shí)和30d均明顯促進(jìn)HCVRNA的復(fù)制及增強(qiáng)HCV蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步的研究表明Vpr可通過上調(diào)miR-122的啟動子活性，precusor miR-122和miR-122 mRNA轉(zhuǎn)錄進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)miR-122的表達(dá)。另外，使用針對miR-

7、122的抑制劑，能顯著阻斷Vpr對HCV5'UTR的上調(diào)作用，同樣還可在JFH1感染系統(tǒng)和OR6細(xì)胞中miR-122抑制劑顯著廢除Vpr對HCVRNA復(fù)制和HCV蛋白的影響。
　　結(jié)論:
　　我們的研究結(jié)果證實(shí)Vpr通過上調(diào)miR-122的轉(zhuǎn)錄水平，并上調(diào)HCV5'UTR的活性，從而促進(jìn)HCVRNA的復(fù)制和增強(qiáng)HCV蛋白的表達(dá)。同時(shí)首次發(fā)現(xiàn)Vpr可從淋巴細(xì)胞中分泌出來，獨(dú)立地進(jìn)入肝細(xì)胞中發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。這些研究結(jié)果說明miR