慢性乙型肝炎和肝癌患者miR-122、miR-375表達(dá)分析.pdf

1、背景和目的：
　　乙肝病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染是一個(gè)引起廣泛肝臟疾病的全球性健康問題，包括急性或慢性乙肝病毒感染。急性HBV感染可治愈或進(jìn)展為慢性。慢性乙型肝炎(chronichepatitisB，CHB)與慢性肝炎、肝硬化和肝癌相關(guān)。據(jù)估計(jì)，全世界超過3.5億病人有慢性HBV感染，這些患者中的大多數(shù)生活在亞太地區(qū)。每年超過一百萬死亡的發(fā)生是由慢性乙型肝炎直接導(dǎo)致。雖然核苷酸類似物藥物、抗病毒核苷酸藥物以

2、及干擾素(IFN)廣泛使用，但仍不能夠使大多數(shù)患者HBV感染終止。更深入地了解HBV與宿主相互作用是新的抗病毒治療策略的前提，近來有關(guān)決定病毒的持久性和清除乙肝病毒復(fù)制過程中的表觀遺傳機(jī)制已進(jìn)行了許多研究和進(jìn)展，包括病毒的DNA甲基化、乙?；M蛋白復(fù)合體和microRNA(miRNA)的調(diào)控。
　　MicroRNAs(miRNAs)是一類長度在18-25個(gè)核苷酸左右的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA。miRNA在進(jìn)化上高度保守，具有轉(zhuǎn)

3、錄后基因調(diào)控功能，在多種生理和病理過程中發(fā)揮作用。人類細(xì)胞基因組編碼有1000多種miRNA，這些miRNA調(diào)節(jié)60％編碼蛋白基因。有研究報(bào)道，在慢性乙型肝炎肝損傷患者和肝癌患者的肝細(xì)胞和外周血清中存在多種miRNA的表達(dá)改變。為了探討miRNA成為慢性乙型肝炎潛在的輔助診斷檢測標(biāo)志物及其與肝癌的關(guān)系，我們對(duì)610例慢性乙肝患者和30例肝癌患者血清和組織中的miR-122和miR-375進(jìn)行了檢測和分析。
　　材料與方法：

4、　　1、標(biāo)本:按照慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)(2010年版)選取2012年-2013年河南省省直第二醫(yī)院、鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，經(jīng)檢測診斷為慢性乙肝病人610例;同時(shí)選取健康體檢者610例作為對(duì)照組;選取2012年-2013年河南省腫瘤醫(yī)院、河南省人民醫(yī)院、鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院原發(fā)肝癌手術(shù)切除病人30例。
　　2、血清標(biāo)本HBVDNA定量檢測:提取各組標(biāo)本血清病毒DNA;采用湖南圣湘生物科技有限公司（PCR-熒光探針法）乙型肝炎病毒(H

5、BV)核酸定量測定試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測。
　　3、血清標(biāo)本乙肝五項(xiàng)定量檢測:使用鄭州安圖綠科生物工程有限公司化學(xué)發(fā)光乙肝五項(xiàng)定量檢測試劑盒對(duì)各組標(biāo)本進(jìn)行檢測。
　　4、血清標(biāo)本中miR-122和miR-375表達(dá)測定:使用天根生化科技（北京）有限公司試劑盒提取血清標(biāo)本中miRNA，然后使用上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司Hairpin-itTMmiRNA（miR-122和miR-375）定量檢測試劑盒檢測血清標(biāo)本中miR-1

6、22和miR-375表達(dá)水平。
　　5、肝癌組織標(biāo)本中miR-122和miR-375表達(dá)測定:提取組織標(biāo)本中miRNA，然后使用上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司Hairpin-itTMmiRNA(miR-122和miR-375)定量檢測試劑盒檢測組織標(biāo)本中miR-122和miR-375表達(dá)水平。
　　6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:使用SPSS17.0軟件分析數(shù)據(jù)，兩樣本間比較使用t檢驗(yàn)，多樣本間比較使用單因素方差分析，P＜0.05作為顯著性水平。

7、
　　結(jié)果：
　　1、HBVDNA檢測結(jié)果:610例慢性乙肝患者HBVDNA均為陽性，其HBVDNA均大于4.001gIU/mL;而對(duì)應(yīng)的610例正常體檢者HBVDNA均為陰性。30例原發(fā)肝癌病人外周血HBVDNA為陽性24例(HBVDNA＞3.001gIU/mL)，陰性6例。
　　2、乙肝五項(xiàng)檢測結(jié)果:健康對(duì)照組610例乙肝五項(xiàng)全部陰性;慢性乙肝組610例HBsAg全部陽性，HBeAg陽性104例，所有指標(biāo)均符合慢性

8、乙肝診斷標(biāo)準(zhǔn)。30例原發(fā)肝癌病人乙肝五項(xiàng)檢測結(jié)果顯示:HBsAg陽性病例24例，與血清HBVDNA檢測結(jié)果一致，其中乙肝大三陽（HBsAg，HBeAg，抗-HBc陽性）病例14例，小三陽（HBsAg，抗-HBe，抗-HBc陽性）病例10例。
　　3、慢性乙肝組和健康對(duì)照組miR-122和miR-375檢測結(jié)果:慢性乙肝組610例標(biāo)本血清中miR-122和miR-375相對(duì)表達(dá)量分別為11.22±2.54和6.62±1.39，均顯著

9、高于健康對(duì)照組，差異有顯著性(p＜0.01)。
　　4、miR-122表達(dá)與慢性乙肝指標(biāo)的關(guān)系:在慢性乙肝組的610例病人中，HBeAg陽性病人的miR-122相對(duì)表達(dá)量最高(13.72±2.41)，HBeAg陰性的非活動(dòng)性攜帶者miR-122相對(duì)表達(dá)量最低(8.12±0.76)，與其他類型差異均有顯著性(p＜0.05)。提示在不同慢性乙肝病人中miR-122表達(dá)水平升高存在差異，其中HBeAg陽性病人的miR-122表達(dá)水平升高

10、最顯著，而HBeAg陰性的非活動(dòng)性攜帶者的miR-122表達(dá)水平升高少。
　　5、miR-375表達(dá)與慢性乙肝指標(biāo)的關(guān)系:在慢性乙肝組的610例病人中，HBeAg陽性病人的miR-375相對(duì)表達(dá)量最高(8.11±1.34)，與非活動(dòng)性攜帶者、高復(fù)制ALT正常病人比較，差異均有顯著性(p＜0.05)。說明在不同慢性乙肝病人中miR-375表達(dá)水平升高存在差異，其中HBeAg陽性病人的miR-375表達(dá)水平升高最顯著。
　　6、

11、肝癌組織miR-122和miR-375檢測結(jié)果:30例肝癌組織中miR-122和miR-375相對(duì)表達(dá)水平分別為16.74±4.31和14.22±3.83，均顯著高于癌旁正常組織，差異有非常顯著性(p＜0.01)。
　　7、miR-122和miR-375與肝癌病理學(xué)特征的關(guān)系:miR-375相對(duì)表達(dá)水平與患者年齡、性別、肝癌的大小、腫瘤分化程度和TNM分期均無關(guān)(p＞0.05);而miR-122相對(duì)表達(dá)水平與肝癌大小、腫瘤分化程度