索拉非尼誘導(dǎo)miR-375的表達上調(diào)抑制肝癌新生血管生成的功能和機制研究.pdf

1、目的：
　　利用miRNA芯片和qRT-PCR篩選和確認索拉非尼處理前后的肝癌細胞中差異性表達的miRNAs。初步探索上述差異表達miRNAs對肝癌新生血管生成的調(diào)控功能和潛在分子機制。
　　方法：
　　第一部分、索拉非尼誘導(dǎo)肝癌細胞miR-375表達上調(diào)
　　1.加入不同濃度的索拉非尼處理Hep3B、HepG248h，明確索拉非尼對Hep3B、HepG2的IC50；
　　2.提取索拉非尼處理前后的肝癌細胞

2、的 RNA行 miRNA芯片檢測分析，篩選差異表達的miRNAs；
　　3.miRNA芯片篩選出 miR-375等差異表達 miRNAs的基礎(chǔ)上，利用qRT-PCR檢測不同濃度的索拉非尼處理前后肝癌細胞中miR-375的表達變化；
　　第二部分、miR-375抑制肝癌新生血管生成的功能和機制研究
　　1.利用qRT-PCR檢測臨床肝癌組織和癌旁組織中；肝癌細胞系Hep3B、HepG2、Huh1、Huh7和正常肝細胞系L

3、O2中miR-375的表達差異；
　　2.利用過表達 miR-375的慢病毒感染肝癌細胞，并用 qRT-PCR確認miR-375在肝癌細胞中的過表達效率；
　　3.利用CCK-8增殖實驗、克隆形成實驗、Transwell實驗、劃痕實驗、凋亡實驗檢測miR-375對肝癌細胞增殖、克隆形成、侵襲、遷移、凋亡的影響；
　　4.利用 HUVEC血管管腔形成實驗、大鼠主動脈環(huán)出芽實驗、雞胚絨毛尿素膜血管生成實驗在體外和體內(nèi)水平分

4、別檢測miR-375對肝癌新生血管生成的影響；
　　5.在生物信息學(xué)軟件預(yù)測 miR-375的潛在下游靶基因 PDGFC的基礎(chǔ)上，利用qRT-PCR、Western blotting、IHC檢測臨床肝癌組織和癌旁組織中PDGFC的表達差異；
　　6.利用qRT-PCR、Western blotting檢測肝癌細胞系Hep3B、HepG2、Huh1、Huh7和正常肝細胞系LO2中PDGFC的表達差異；利用慢病毒載體和miR-3

5、75的抑制物分別在肝癌細胞中過表達和下調(diào)表達miR-375，利用 qRT-PCR、Western blotting和 Elisa檢測 PDGFC的表達變化，明確miR-375對PDGFC的調(diào)控功能；
　　7.利用雙熒光素酶實驗明確miR-375對PDGFC調(diào)控的分子機制；
　　8.在肝癌細胞過表達miR-375的同時外源性補充人重組PDGFCC蛋白和用RNAi實驗敲除PDGFC,利用HUVEC血管管腔形成、大鼠主動脈環(huán)出芽和

6、雞胚絨毛膜尿素膜血管生成等“挽救實驗”明確miR-375是否通過直接調(diào)控PDGFC的表達抑制肝癌新生血管的生成；
　　9.利用裸鼠成瘤實驗在整體動物水平檢測miR-375對裸鼠腫瘤生長、血管生成及生存時間的影響；
　　10.在索拉非尼處理肝癌細胞的同時，采用miR-375的抑制物下調(diào)表達miR-375，利用qRT-PCR和Western blottng檢測PDGFC的表達變化；明確索拉非尼是否通過誘導(dǎo)miR-375表達上調(diào)抑

7、制PDGFC的表達；
　　第三部分、miR-375調(diào)控肝癌細胞PDGFC下游信號通路的初步研究
　　利用 Western blotting檢測過表達和下調(diào)表達miR-375后AKT，ERK1/2的磷酸化水平；
　　結(jié)果：
　　第一部分、索拉非尼誘導(dǎo)肝癌細胞miR-375表達上調(diào)
　　1.索拉非尼對Hep3B、HepG2的IC50分別為2.77uM、3.28uM；
　　2.miRNA芯片結(jié)果顯示：索拉非

8、尼可誘導(dǎo)包括 miR-375在內(nèi)的miRNAs表達上調(diào)；
　　抑制肝癌新生血管生成；
　　3.qRT-PCR結(jié)果顯示：索拉非尼濃度依賴性誘導(dǎo)肝癌細胞miR-375表達上調(diào)；
　　第二部分、miR-375抑制肝癌新生血管生成的功能和機制研究
　　1.qRT-PCR結(jié)果顯示：miR-375在臨床肝癌組織中的表達明顯低于癌旁組織，miR-375在肝癌細胞系Hep3B、HepG2、Huh1、Huh7中的表達明顯低于正常肝

9、細胞系LO2；
　　2.慢病毒感染后見大量綠色熒光蛋白表達， qRT-PCR結(jié)果顯示：miR-375過表達成功；
　　3.CCK-8增殖實驗和克隆形成實驗結(jié)果顯示：miR-375明顯抑制肝癌細胞的增殖能力和克隆形成能力；Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示：miR-375明顯抑制肝癌細胞的侵襲能力；Transwell遷移實驗、劃痕實驗結(jié)果顯示：miR-375明顯抑制肝癌細胞的遷移能力；凋亡實驗結(jié)果顯示：miR-375明顯促進肝

10、癌細胞凋亡；
　　4.HUVEC血管管腔形成實驗結(jié)果顯示：miR-375明顯抑制HUVEC血管管腔形成；大鼠主動脈環(huán)出芽實驗結(jié)果顯示：miR-375明顯抑制大鼠主動脈環(huán)的出芽及生長；雞胚絨毛尿素膜血管生成實驗結(jié)果顯示：miR-375明顯抑制雞胚絨毛尿素膜血管生成；
　　5.生物信息學(xué)軟件targetscan7.1預(yù)測PDGFC可能是miR-375的下游靶基因；qRT-PCR、Western blotting、IHC結(jié)果顯示：

11、臨床肝癌組織中PDGFC的表達明顯高于癌旁組織；
　　6.qRT-PCR、Western blotting結(jié)果顯示：肝癌細胞系Hep3B、HepG2、Huh1、Huh7中 PDGFC的表達明顯高于正常肝細胞系 LO2；qRT-PCR、Western blotting、Elisa結(jié)果顯示：過表達miR-375后PDGFC的表達下降，抑制miR-375表達后PDGFC的表達升高；
　　7.雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示：miR-37

12、5直接作用于PDGFC-3，UTR；
　　8.HUVEC血管管腔形成、大鼠主動脈環(huán)出芽、雞胚絨毛膜尿素膜血管生成等“挽救實驗”和RNAi實驗顯示：miR-375直接通過調(diào)控PDGFC表達抑制肝癌新生血管生成；
　　9.裸鼠成瘤實驗結(jié)果顯示：miR-375直接通過調(diào)控PDGFC表達抑制腫瘤生長、減少腫瘤血管的生成，明顯延長裸鼠的生存時間；
　　10.qRT-PCR、Western blottng結(jié)果提示：索拉非尼通過誘導(dǎo)

13、 miR-375表達上調(diào)抑制PDGFC表達；
　　第三部分、miR-375調(diào)控肝癌細胞PDGFC下游信號通路的初步研究
　　Western blotting結(jié)果提示：過表達miR-375明顯抑制AKT、ERK1/2磷酸化；下調(diào)表達miR-375明顯促進AKT、ERK1/2磷酸化；
　　結(jié)論：
　　1.索拉非尼濃度依賴性誘導(dǎo)肝癌細胞miR-375上調(diào)表達。
　　2.miR-375通過抑制PDGFC的表達抑制肝