miR-107和Shh調(diào)控大鼠腦梗塞后血管新生以及血管新生成熟的機(jī)制研究.pdf

1、[目的]闡明 miR-107信號途徑在腦梗死后促進(jìn)血管新生的作用和特點(diǎn)，篩選驗證miR-107直接靶點(diǎn)以及下游調(diào)控通路，探討miR-107調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)從而促進(jìn)血管新生的分子學(xué)機(jī)制。揭示Shh信號與VEGF、血管生成素-1（Ang-1）和Ang-2的相關(guān)性，研究Sonic Hedgehog（Shh）信號協(xié)同調(diào)控VEGF、Ang-1和Ang-2的分子機(jī)制。明確腦梗死后，miR-107對血管新生的調(diào)控作用，以及Shh信號通

2、路對新生血管成熟的作用，為腦梗死治療中血管新生和重建的靶向治療提供理論依據(jù)。
　　[方法]本研究包括體內(nèi)、體外兩部分。體內(nèi)：建立大鼠大腦中動脈梗塞模型（MCAO），并分為未處理的組（對照組），假手術(shù)組及給藥組。體外：培養(yǎng)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞
　?。≧BMECs）、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（astrocytes），并在糖氧剝奪模型（OGD）條件下進(jìn)行機(jī)制研究。
　　①分別在體內(nèi)、體外采用免疫熒光、Wes

3、tern Blo t、RT-PCR觀察miR-107表達(dá)水平、Shh-VEGF/Ang-1/Ang-2表達(dá)水平，分析 Shh信號與VEGF、Ang-1和Ang-2表達(dá)水平的相關(guān)性，觀察VEGF、Ang-1和Ang-2在糖氧剝奪條件下的時間變化規(guī)律。②采用劃痕實驗、Transwell、BD基質(zhì)膠管腔形成觀察miR-107對RBMECs和HUVECs的遷移及管腔形成的作用。③應(yīng)用基因芯片、miRanda，RNAhybrid和Tar-getS

4、can三大基因庫比對，雙熒光素酶實驗篩選驗證miR-107下游靶基因。④體內(nèi)經(jīng)側(cè)腦室注射Agomir-107、AntagomiR-107；體外構(gòu)建慢病毒，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染干預(yù)調(diào)控miR-107表達(dá)，觀察對血管新生數(shù)目，以及下游靶基因Dicer-1、下游信號通路VEGF的調(diào)控。⑤星形膠質(zhì)細(xì)胞外源性給予Shh類似物或Shh抑制劑5EI/環(huán)王巴明，采用Western Blot、RT-PCR驗證 VEGF、Ang-1和Ang-2表達(dá)水平時間上的變化。⑥

5、構(gòu)建慢病毒，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)或者下調(diào)Gli-1或NR2F2，探討Shh同步調(diào)控VEGF、Ang-1和Ang-2的分子機(jī)制。
　　[結(jié)果]
　　1.大鼠MCAO后3-7d，miR-107表達(dá)水平升高，側(cè)腦室注射外源性抑制miR-107表達(dá)發(fā)現(xiàn)血管新生數(shù)目明顯減少。
　　2.上調(diào)或者下調(diào)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（RBMECs）和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）中miR-107水平，可顯著提高或降低內(nèi)皮瞎報遷移和進(jìn)管腔形成能

6、力。
　　3.糖氧剝奪（OGD）模型下，上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞miR-107表達(dá)可顯著提高其VEGF165(4)蛋白和mRNA表達(dá)水，但miR-107調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞中VEGF165(4)表達(dá)不明顯。
　　4.通過基因芯片篩選出96個miR-107下游靶基因，其中雙熒光素酶證實Dicer-1為miR-107直接靶點(diǎn)。阻斷Dicer-1后，OGD條件下降低內(nèi)皮細(xì)胞中miR-107表達(dá)，miR-107不能引起VEGF165(4)表達(dá)水平的

7、變化。
　　5.大鼠MCAO后側(cè)腦室給予miR-107可明顯增加血管數(shù)目，減少梗塞體積、miR-107或可作為血管新生的治療靶點(diǎn)。
　　6.糖氧剝奪（OGD）模型下，星形膠質(zhì)細(xì)胞VEGF、Ang-2表達(dá)水平明顯升高，Ang-1表達(dá)水平無明顯變化,三者表達(dá)水平在時間軸上不同步。
　　7.外源性給予Shh可在1h內(nèi)提高星形膠質(zhì)細(xì)胞中VEGF、Ang和Ang-2表達(dá)水平，并且與VE GF表達(dá)水平升高的時間點(diǎn)相一致。
　

8、　8.星形膠質(zhì)細(xì)胞中下調(diào)NR2F2信號分子，則可阻斷Shh對VEGF/Ang-1/Ang-2調(diào)控作用，而阻斷經(jīng)典的Gli-1信號途徑，發(fā)現(xiàn)Shh對VEGF/Ang-1/Ang-2調(diào)控作用未受影響。
　　[結(jié)論]
　?、俅笫驧CAO后，miR-107作為促進(jìn)血管新生的重要信號分子，可通過直接結(jié)合Dicer-1提高內(nèi)皮細(xì)胞源性VEGF165(4)表達(dá)水平，提高 RBMECs和HUVECs的遷移能力，促進(jìn)血管新生，從而顯著減少腦梗

9、塞體積。②在血管新生的基礎(chǔ)上，S hh可通過非經(jīng)典信號途徑NR2F2，調(diào)控VEGF、Ang-1、Ang-2表達(dá)水平同步提高，促使新生血管成熟。對以上兩方面分子機(jī)制的深入研究，期望為腦梗塞后血管新生作為治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。
　　[創(chuàng)新與不足]
　　創(chuàng)新之處：
　　1.將調(diào)控 mic roRN A作為促進(jìn)血管新生的新靶點(diǎn)，探索促進(jìn)腦卒中后腦血流灌的新策略。探套miR-107對RBMECs和HUVECs遷移能力及管腔形成的影響

10、，發(fā)現(xiàn)miR-107調(diào)控血管新生的作用。
　　2.采用基因芯片（ge ne c hip）實驗篩選miR-107的下游靶基因，并通過雙熒光素酶驗證Dicer-1為miR-107下游直接靶基因。
　　3.證實miR-107通過直接結(jié)合Dicer-1調(diào)控VEGF164，促進(jìn)血管新生的分子機(jī)制。明確腦梗死后miR-107對受損腦組織的保護(hù)作用，以及外源性給予miR-107促進(jìn)腦梗塞大鼠神經(jīng)功能評分恢復(fù)的作用，為治療腦梗死提供新靶點(diǎn)和

11、新思路，具有重要的臨床價值和廣闊的發(fā)展前景。
　　4.探索腦缺血后 Shh與傳統(tǒng)血管生成因子家族 VEGF和Angs的相關(guān)性，通過比較 Shh信號與 VEGF和Angs促進(jìn)血管新生的各自特點(diǎn)，采用基因沉默的方法，明確 VEGF和Angs是否為 Shh的下游，闡明 Shh可能是促進(jìn)腦梗塞后血管成熟的更加理想的信號途徑。
　　不足之處：
　　在探討Shh協(xié)同調(diào)控VEGF、Ang-2和Ang-1部分雖深入探討了分子調(diào)控機(jī)制，