RhoC調(diào)控肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移和新生血管生成的體內(nèi)外研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(HCC)是當(dāng)前嚴(yán)重威脅我國(guó)人民健康最主要的惡性腫瘤。HCC術(shù)后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致HCC患者死亡率居高不下的最主要的原因。深入研究HCC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的機(jī)制和積極探索有效的抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移治療措施是當(dāng)前HCC診治中的重點(diǎn)和難點(diǎn)，意義重大。 Rho蛋白是一種分子量為21K-30Kda的單體鳥(niǎo)核苷酸調(diào)節(jié)蛋白，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其所介導(dǎo)的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)可能在惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道RhoC的表達(dá)或是活性升高與侵襲性乳癌、

2、黑色素瘤、胰腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌和胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，先前的研究也發(fā)現(xiàn)RhoC的表達(dá)升高與HCC的侵襲轉(zhuǎn)移成正相關(guān)，高表達(dá)RhoC的HCC患者預(yù)后較差。這些結(jié)果提示RhoC可能在HCC的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。但是，目前尚無(wú)研究闡明RhoC調(diào)控HCC侵襲轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制。 第一部分通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的小RNA干擾技術(shù)特異性抑制肝癌細(xì)胞中RhoC的表達(dá)，探討RhoC調(diào)控HCC侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，同時(shí)探討通過(guò)體內(nèi)抑

3、制RhoC的表達(dá)而抑制HCC侵襲轉(zhuǎn)移的可行性。獲得了以下研究結(jié)果： 1．在HepG2、MHCC97-L、HCCLM3，三種侵襲轉(zhuǎn)移能力依次升高的肝癌細(xì)胞系中用半定量RT-PCR的方法檢測(cè)了RhoGTPase家族主要成員Rac1、Cdc42、RhoA、RhoB、RhoC mRNA的表達(dá)。用Western Blot方法檢測(cè)了RhoC蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示：RhoC mRNA和蛋白的表達(dá)水平在高侵襲轉(zhuǎn)移能力的HCCLM3肝癌細(xì)胞系中明顯

4、升高。提示RhoC的高表達(dá)與肝癌細(xì)胞系侵襲轉(zhuǎn)移潛能呈正相關(guān)。 2．設(shè)計(jì)、構(gòu)建了RhoC的siRNA質(zhì)粒，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染并經(jīng)G418篩選，獲得了穩(wěn)定表達(dá)RhoCsiRNA有效片斷和無(wú)效對(duì)照片斷的HCCLM3細(xì)胞(HCCLM3<'RhoCRNAi+>和HCCLM3<'RhocRNAi->)。Western Blot結(jié)果顯示HCCLM3<'RhocRNAi+>中KhoC的表達(dá)明顯下調(diào)，RT-PCR結(jié)果顯示在RhoC表達(dá)被顯著抑制的

5、同時(shí)，僅有RhoA的輕度升高，而Rac1、Cde42、RhoB的表達(dá)無(wú)明顯變化。這提示本研究中采用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的小RNA干擾技術(shù)有效特異地抑制了HCCLM3肝癌細(xì)胞中RhoC的表達(dá)。 3．劃痕實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示HCCLM3<'RhoCRNAi+>較HCCLM3<'RhoCRNAi->細(xì)胞遷移能力明顯下降；Transwell侵襲小室測(cè)定法結(jié)果顯示HCCLM3<'RhoCRNAi+>較HCCLM3<'RhocRNAi->細(xì)胞侵襲能力明

6、顯下降；MTT法結(jié)果顯示HCCLM3<'RhoCRNAi+>和HCCLM3<'RhoCRNAi->兩組細(xì)胞增殖能力差異不具有顯著性意義；Annexin V和PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞儀技術(shù)結(jié)果顯示HCCLM3<'RhoCRNAi+>和HCCLM3<'RhoCRNAi->兩組細(xì)胞的凋亡差異不具有顯著性意義。這些結(jié)果提示在體外實(shí)驗(yàn)中抑制RahoC的表達(dá)可以抑制肝癌細(xì)胞的侵襲遷移而不影響其增殖和凋亡。 4．已有研究發(fā)現(xiàn)Autotaxin(

7、ATX)能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，推測(cè)這一過(guò)程依賴于RhoC的參與。采用Transwell侵襲小室測(cè)定法確定了ATX能夠誘導(dǎo)HCCLM3肝癌細(xì)胞的侵襲遷移；pulldown實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ATX能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞中RhoC的活化；細(xì)胞熒光顯示ATX能夠誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架(F-actin)發(fā)生形變；Transwell侵襲小室測(cè)定法顯示抑制RhoC的表達(dá)可以抑制ATX誘導(dǎo)的HCCLM3肝癌細(xì)胞的侵襲遷移。這些結(jié)果提示RhoC參與了ATX誘導(dǎo)的

8、肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。 5．在HCCLM3轉(zhuǎn)移性人肝癌細(xì)胞裸鼠模型的基礎(chǔ)上，建立了逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的RhoCsiRNA干預(yù)模型。免疫組化檢測(cè)GFP和RhoC的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)移性人肝癌細(xì)胞裸鼠模型中皮下種植產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細(xì)胞能夠感染靶細(xì)胞并有效的抑制其RhoC的表達(dá)。裸鼠肺組織連續(xù)切片計(jì)數(shù)肺轉(zhuǎn)移的數(shù)目，結(jié)果顯示體內(nèi)抑制RhoC的表達(dá)能夠抑制肝癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移。連續(xù)監(jiān)測(cè)皮下種植HCCLM3原發(fā)瘤的大小，結(jié)果顯示體內(nèi)抑制RhoC

9、的表達(dá)能夠抑制HCCLM3原發(fā)瘤的生長(zhǎng)。免疫組化檢測(cè)HCCLM3原發(fā)瘤中的微血管密度(MVD)，結(jié)果提示體內(nèi)抑制RhoC的表達(dá)能夠抑制肝癌的生長(zhǎng)可能與抑制腫瘤血管生成有關(guān)。 結(jié)果提示體內(nèi)抑制RhoC的表達(dá)可以抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。肝癌新生血管生成是一個(gè)多步驟、多因素、序貫的過(guò)程。新生血管生成始終且必須依賴于血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和運(yùn)動(dòng)。已有研究揭示了RhoA對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的關(guān)鍵性作用。先前的研究提示RhoC可能在肝癌新生血管生成過(guò)程中

10、起關(guān)鍵性作用。 第二部分利用一系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以及體內(nèi)外新生血管生成模型，對(duì)RhoC在新生血管生成中的作用以及調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究，獲得如下結(jié)果： 1．利用本研究第一部分獲得的含RhoCsiRNA表達(dá)片斷的逆轉(zhuǎn)錄病毒的上清，三重瞬時(shí)感染人微血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1，熒光顯微鏡計(jì)數(shù)EGFP表達(dá)細(xì)胞數(shù)評(píng)價(jià)感染效率，Western blot檢測(cè)RhoC蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示成功地抑制了HMEC-1細(xì)胞中RhoC的表達(dá)。 2．劃痕實(shí)

11、驗(yàn)結(jié)果顯示HMEC-1<'RhoCRNAi+>較HMEC-1<'RhoCRNAi->的遷移能力明顯下降；Transwell侵襲小室測(cè)定法結(jié)果顯示HMEC-1<'RhoCRNAi+>較HMEC-1<'RhoCRNAi->的侵襲能力明顯下降；MTT法結(jié)果顯示HMEC-1<'RhoCRNAi+>和HMEC-1<'RhoCRNAi->的增殖能力差異不具有顯著性意義；AnnexinV和PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞儀技術(shù)結(jié)果顯示HMEC-1<'RhoCR

12、NAi+>和HMEC-1<'RhoCRNAi->的凋亡差異不具有顯著性意義。這些結(jié)果提示在體外實(shí)驗(yàn)中抑制RhoC的表達(dá)可以抑制人微血管內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1的侵襲遷移而不影響其增殖和凋亡。 3．將HMEC-1內(nèi)皮細(xì)胞種植于Matrigel上構(gòu)建了二維血管新生模型，結(jié)果顯示抑制HMEC-1中RhoC的表達(dá)可以抑制其形成網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)；用結(jié)合羅丹明的鬼筆毒素特異性的標(biāo)記Matrigel上內(nèi)皮細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，結(jié)果顯示抑制ghoC可以

13、抑制內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生形變；將HMEC-1內(nèi)皮細(xì)胞包被微載體球后種植于Matrigel中構(gòu)建了三維血管新生模型，結(jié)果顯示抑制HMEC-1中RhoC的表達(dá)可以抑制其在三維環(huán)境中形成三維管狀結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果說(shuō)明體外抑制RhoC的表達(dá)可以抑制HMEC-1人微血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成。 4．將產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細(xì)胞種植于裸鼠皮下并成瘤，同時(shí)將混合了VEGF的Matrigel種植于裸鼠皮下做為血管新生的誘生物，建立了研究新生血管生成的體內(nèi)模型。結(jié)果