Caveolin-1調(diào)控肝細(xì)胞癌血管生成的初步研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carclnoma，HCC)是世界上最常見(jiàn)的實(shí)體惡性腫瘤之一，手術(shù)切除和肝移植仍是目前最有效的治療手段，但療效不佳，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是其最主要原因。HCC是富血供腫瘤，血管生成被認(rèn)為與HCC的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用參與了該過(guò)程。 Caveolin-1是細(xì)胞膜上內(nèi)陷微區(qū)域的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。目前，對(duì)caveolin-1

2、在不同腫瘤中的作用尚存在著兩種完全不同的觀點(diǎn)。Caveolin-1最初被認(rèn)為是抑癌基因，但最近越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，caveolin-1過(guò)表達(dá)參與了腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成。在有關(guān)HCC的研究中發(fā)現(xiàn)，下調(diào)caveolin-1能抑制不同淋巴道侵襲能力小鼠HCC的侵襲轉(zhuǎn)移。本研究所前期采用SuperArray基因芯片技術(shù)對(duì)HCC轉(zhuǎn)移相關(guān)基因進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)caveolin-1是重要的促轉(zhuǎn)移候選基因之一。這些研究提示，caveolin-1參與了H

3、CC的侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成，但其機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。已有研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是HCC血管生成中最主要的刺激因子，但多數(shù)研究caveolin-1與VEGF誘導(dǎo)血管生成之間的關(guān)系都集中在內(nèi)皮細(xì)胞上，而對(duì)腫瘤細(xì)胞上caveolin-1表達(dá)是否與VEGF誘導(dǎo)的血管生成有關(guān)尚不清楚。 基于以上研究背景，本研究采用免疫組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)、qRT-PCR

4、及Westernblot技術(shù)檢測(cè)HCC組織標(biāo)本和肝癌細(xì)胞株中caveolin-1的表達(dá)，并分析caveolin-1與HCC臨床病理學(xué)因素、VEGF及腫瘤血管生成相關(guān)指標(biāo)(腫瘤微血管密度(MVD)、非成對(duì)動(dòng)脈(UA))之間的相關(guān)性；利用慢病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建caveolin-1 RNA干擾載體，并借助qRT-PCR、ELISA、侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)分析其對(duì)人肝細(xì)胞癌株SMMC7721 VEGF表達(dá)和侵襲、運(yùn)動(dòng)能力的影響：利用MTT法和二維凝膠血

5、管生成體外模型探討下調(diào)SMMC7721細(xì)胞中caveolin-1表達(dá)的培養(yǎng)上清液對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilical vein endothelial cells，HUVEC)增殖和VEGF誘導(dǎo)的血管生成的影響。 主要結(jié)果和結(jié)論如下： 第一部分：Caveolin-1在HCC中的表達(dá)及臨床意義 1、26例伴肝內(nèi)轉(zhuǎn)移的HCC組織標(biāo)本中，癌組織內(nèi)caveolin-1 mRNA表達(dá)水平高于正常肝組織、肝硬

6、化組織和癌旁組織，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.046、0.021、0.039)。75例HCC組織標(biāo)本行免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示，量化分析caveolin-1表達(dá)強(qiáng)度(P=0.001)、陽(yáng)性百分比(P=0.002)、計(jì)分(P=0.001)均與轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。Caveolin-1表達(dá)強(qiáng)弱與VEGF(r=0.293，P=0.011)、MVD(r=0.361，P=0.001)、UA(r=0.388，P=0.001)均呈顯著正相關(guān)。生存分析發(fā)現(xiàn)，ca

7、veolin-1高表達(dá)患者預(yù)后比低表達(dá)者差(P=0.014)。單變量分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤大小、門靜脈癌栓、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、caveolin-1表達(dá)強(qiáng)弱、VEGF表達(dá)水平、MVD和UA都是HCC的重要預(yù)后因素；但多變量分析(COX回歸模型)發(fā)現(xiàn)，只有腫瘤大小和VEGF表達(dá)水平是其獨(dú)立預(yù)后因素，而caveolin-1表達(dá)水平并非其獨(dú)立預(yù)后因素。 2、在HepG2和SMMC7721肝癌細(xì)胞株中，免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，Caveolin-1在SMMC

8、7721呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而在HepG2中未見(jiàn)明顯表達(dá)；Western blot檢測(cè)結(jié)果與免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果一致，且發(fā)現(xiàn)在SMMC7721中caveolin-1表達(dá)與VEGF高表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.888，P<0.01)；qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，SMMC7721細(xì)胞中caveolin-1mRNA表達(dá)水平明顯高于HepG2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。侵襲實(shí)驗(yàn)分析證實(shí)了SMMC7721的侵襲能力高于HepG2(P=0.003)。

9、 第二部分：Caveolin-1 RNAi慢病毒載體構(gòu)建及其對(duì)人肝細(xì)胞癌株SMMC7721VEGF表達(dá)和侵襲、運(yùn)動(dòng)能力的影響 1、成功構(gòu)建慢病毒系統(tǒng)介導(dǎo)的caveolin-1 RNAi載體，其可較長(zhǎng)時(shí)間、穩(wěn)定表達(dá)于SMMC7721，感染5天后轉(zhuǎn)導(dǎo)效率為(96.0±1.2)％，并能顯著敲除靶細(xì)胞SMMC7721中目的基因caveolin-1的mRNA(敲除率約90％)和蛋白表達(dá)。 2、沉默Caveolin-1能顯著降

10、低SMMC7721細(xì)胞內(nèi)VEGF mRNA表達(dá)水平，相對(duì)陰性感染對(duì)照組下降水平約50％(P<0.05)； ELISA法檢測(cè)顯示分泌至胞外的VEGF蛋白水平表達(dá)約下降20％(P<0.05)。 3、Caveolin-1下調(diào)能顯著抑制SMMC7721的侵襲和運(yùn)動(dòng)能力，各個(gè)時(shí)相點(diǎn)相對(duì)對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均小于0.01)；給予外性性重組人VEGF后能顯著恢復(fù)其侵襲能力(P<0.05)，證實(shí)caveolin-1可通過(guò)調(diào)控VEGF參與

11、HCC的侵襲轉(zhuǎn)移。 第三部分：SMMC7721 Caveolin-1沉默培養(yǎng)上清液對(duì)HUVEC eNOS表達(dá)和內(nèi)皮細(xì)胞增殖、成管的影響 1、采用原代培養(yǎng)的HUVEC可較好的保持其純度和降低變異程度。Caveolin-1RNAi后SMMC7721培養(yǎng)上清液使HUVEC細(xì)胞活力顯著下降，增殖能力受到抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 2、Caveolin-1 RNAi后SMMC7721細(xì)胞上清液能顯著抑制HUV

12、EC管腔結(jié)構(gòu)的形成(P<0.05)，給予外源性重組人VEGF后可恢復(fù)HUVEC管腔結(jié)構(gòu)的形成(P<0.05)，CD34標(biāo)記的免疫組化檢測(cè)結(jié)果證實(shí)了該結(jié)果。 3、SMMC7721細(xì)胞caveolin-l沉默后上清液能顯著抑制HUVEC細(xì)胞上eNOSser-1177位點(diǎn)的磷酸化(P<0.05)，于24h抑制最為明顯，而eNOS總蛋白表達(dá)沒(méi)有發(fā)生變化。 綜上所述，本研究主要結(jié)論如下： 1、人HCC組織中caveolin

13、-1表達(dá)水平升高與腫瘤轉(zhuǎn)移、預(yù)后差和腫瘤血管生成顯著正相關(guān)；高侵襲潛能人肝細(xì)胞癌株SMMC7721中caveolin-1表達(dá)較高，并與VEGF表達(dá)升高呈顯著正相關(guān)。Caveolin-1可能是預(yù)測(cè)HCC侵襲轉(zhuǎn)移潛能和預(yù)后的指標(biāo)之一。 2、利用慢病毒系統(tǒng)成功構(gòu)建的caveolin-1 RNAi載體可較長(zhǎng)時(shí)間、穩(wěn)定表達(dá)于SMMC7721，并能顯著下調(diào)其caveolin-1的表達(dá)；沉默caveolin-1能顯著降低SMMC7721細(xì)胞內(nèi)

14、VEGF mRNA表達(dá)及其分泌至胞外的VEGF蛋白表達(dá)水平；Caveolin-1下調(diào)能顯著抑制SMMC7721的侵襲和運(yùn)動(dòng)能力，給予外源性重組人VEGF后能恢復(fù)其侵襲能力，證實(shí)caveolin-1可通過(guò)調(diào)控VEGF參與HCC的侵襲轉(zhuǎn)移。 3、人肝細(xì)胞癌株SMMC7721中caveolin-1沉默引起的分泌型VEGF表達(dá)下調(diào)能顯著抑制HUVEC的增殖能力；利用基質(zhì)膠構(gòu)建的二維凝膠血管生成體外模型發(fā)現(xiàn)，caveolin-1沉默的人肝