Caveolin-1在氧化應激致肺血管通透性增加中的作用和調(diào)控機制.pdf

1、研究目的:血管通透性(vascular permeability)增加及其引起的組織水腫是多種炎癥性疾病如急性肺損傷(acute lung injury)等共同的病理特點。其包括跨細胞通透性(transcellular:permeabilit),)和細胞旁通透性(paracellular permeability)兩個方面。在生理條件下,內(nèi)皮細胞間連接嚴格限制血液中生物大分子如白蛋白的通過,血管內(nèi)皮對白蛋白的基礎(chǔ)通透性主要取決于cave

2、olae介導的的跨細胞轉(zhuǎn)運(transcytosis)。病理情況下,活性氧(reactive oxygen species,ROS)包括超氧陰離子(·O2-)、過氧化氫(H2O2)等產(chǎn)生增加,形成氧化應激狀態(tài),是誘導血管通透性增加的一個重要因素,但其作用機制尚不完全清楚。有研究表明,氧化劑主要通過破壞細胞間連接從而增加細胞旁通透性。
　　 Caveolin-1(Cav-1)為分子量為21-24kDa的整合膜蛋白,是caveola

3、e的主要結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)蛋白,在內(nèi)皮細胞中表達豐富。我們前期的研究表明,caveolae介導的白蛋白跨細胞轉(zhuǎn)運,不僅在生理狀態(tài)下維持正常的組織膠體滲透壓起決定性作用,而且在炎癥(如活化的中性粒細胞)導致的肺血管通透性增加中也起重要作用,且此過程依賴于Cav-1的磷酸化。此外,近期多項研究也指出,Cav-1也參與了對細胞間粘附和細胞旁通透性的調(diào)節(jié)。但是,Cav-1對氧化應激致肺血管通透性增加的兩條途徑的調(diào)節(jié)作用及其調(diào)控機制目前尚無報道。

4、　　 研究方法:本研究用H2O2作為外源性ROS的來源,誘導氧化應激。體外實驗利用培養(yǎng)的大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞(Rat lung microvascular endothelial cells,RLMVECs),或用野生型Cav-1(WT-Cav-1)cDNA和不能被磷酸化的突變型Cav-1(Y14F-Cav-1)cDNA轉(zhuǎn)染RLMVECs,構(gòu)建兩種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系,其中內(nèi)源性Cav-1的表達水平未改變,但是外源性Y14F-Cav-1具有

5、顯性負效應(dominant-negativeeffecf)可同時抑制內(nèi)源性Cav-1的磷酸化,研究H2O2誘導的Cav-1磷酸化對白蛋白跨細胞通透性和細胞旁通透性的調(diào)節(jié)作用和調(diào)控機制。免疫沉淀和免疫印跡法檢測蛋白Cav-1、Src激酶和c-Abl激酶的磷酸化水平。利用小干擾RNA(Small interferingRNA,siRNA)介導的基因沉默技術(shù),抑制Cav-1并c-Abl激酶的表達。以甲基環(huán)糊精(methyl-β-cyclod

6、extrin,MβCD)和Src激酶抑制劑PP2分別破環(huán)caveolae結(jié)構(gòu)和抑制Src激酶活性。利用放射性同位素碘125(125Ⅰ)標記的白蛋白檢測白蛋白的內(nèi)吞和跨細胞轉(zhuǎn)運。免疫熒光和共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測白蛋白內(nèi)吞,Cav-1和β-catenin的細胞定位和共定位并且觀察細胞間連接的完整性。測定跨內(nèi)皮電阻(transendothelialelectrical resistance,TER),反映內(nèi)皮屏障功能(細胞旁通透性)的變化。免疫

7、共沉淀技術(shù)測定Cav-1和β-catenin,β-catenin和VE-cadherin之間的相互作用及其變化。利用細胞膜和細胞質(zhì)分離技術(shù)檢測蛋白的轉(zhuǎn)位。
　　 體內(nèi)實驗用野生型(Cav-1+/+)和Cav-1基因敲除(Cav-1-/-)小鼠,采用新鮮制備的脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)染法,將WT-Cav-1和Y14F-Cav-1 cDNA轉(zhuǎn)染到Cav-1-/-小鼠體內(nèi),使肺血管內(nèi)皮細胞重新表達Cav-1蛋白(WT-Cav-1或者Y14F

8、-Cav-1),然后利用小鼠的原位離體肺灌流模型,研究H2O2誘導的Cav-1磷酸化在肺血管通透性增加和肺水腫形成中的作用。免疫印跡法檢測Cav-1和磷酸化Cav-1的蛋白表達。測定125Ⅰ標記白蛋白的血管外漏出量,計算肺白蛋白通透性和表面積的乘積(Permeability-surface area[PS]product,定量評價肺微血管通透性。測量肺的濕干比,判斷肺水腫程度。
　　 結(jié)果:體外實驗結(jié)果(1)H2O2(0.05-

9、0.8mmol/L)可增加Cav-1氨基端的第14位酪氨酸磷酸化,并呈濃度依賴性。從5min開始升高,30min達最高峰,60min恢復到基礎(chǔ)水平。同時,Src激酶的第418位酪氨酸磷酸化與Cav-1的磷酸化同步增加；c-Abl激酶的磷酸化也呈濃度依賴性的增高。低濃度H2O2(0.2mmol/L)引起的Cav-1磷酸化可被PP2完全抑制,而c-Abl siRNA對其無抑制作用。高濃度的H2O2(0.6mmol/L)誘導的磷酸化,只能部分

10、被PP2抑制,并且c-Abl siRNA對其也有部分抑制作用。另外發(fā)現(xiàn),PP2可明顯抑制c-Abl激酶的磷酸化。(2)H2O2(0.05-0.2mmol/L)不損傷細胞間連接,不破環(huán)內(nèi)皮屏障功能,但是可以濃度依賴性的增加白蛋白的細胞內(nèi)吞和跨細胞轉(zhuǎn)運,從而增加跨細胞通透性。并且發(fā)現(xiàn),H2O2誘導的白蛋白內(nèi)吞和跨細胞轉(zhuǎn)運,可以被MβCD、Cav-1 siRNA以及PP2阻斷,但是不受c-Abl激酶活性的影響,揭示磷酸化的Cav-1發(fā)揮重要作

11、用。進一步實驗顯示,過表達Y14F-Cav-1與過表達WT-Cav-1的細胞相比,明顯減弱了H2O2介導的白蛋白內(nèi)吞和跨細胞轉(zhuǎn)運。(3)H2O2(0.4-0.8mmol/L)可降低TER,誘導內(nèi)皮細胞間隙形成,其中H2O2(0.4-0.6mmol/L)誘導的TER的降低可在5h內(nèi)完全恢復,所以選擇0.6mmol/LH2O2作為破壞正常細胞間連接,增加細胞旁通透性的藥物濃度。結(jié)果顯示,與正常細胞相比,0.6mmol/L H2O2可使過表達

12、WT-Cav-1細胞的TER降低進一步加劇,而過表達Y14F-Cav-1的細胞、PP2和c-Abl siRNA均可使TER降低的幅度減弱,且c-Abl siRNA與PP2相比,可使TER更快恢復。更值得注意的是,0.2mmol/L H2O2就足以使過表達WT-Cav-1的細胞TER明顯降低,而此濃度對于正常細胞和過表達Y14F-Cav-1的細胞無效；(4)免疫熒光結(jié)果顯示,在正常情況下,存在明顯的Car-1與β-catenin共定位于細

13、胞-細胞鄰接處。免疫共沉淀也表明,Cav-1與β-catenin間存在相互作用。0.6mmol/L H2O2可降低Cav-1與β-catenine的相互作用,使β-catenin由細胞膜轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì),破壞β-catenin和VE-cadherin的復合體,并觀察到細胞間隙。而對于過表達WT-Cav-1的細胞,0.2mmol/L H2O2即可引起上述變化,但對于過表達Y14F-Cav-1的細胞無影響。
　　 體內(nèi)實驗結(jié)果表明,0.

14、5mmol/L H2O2處理Cav-1+/+小鼠,可增加PS product和肺濕干比。而處理Cav-1-/-小鼠,PS product和肺濕干比未見增加。重新表達WT-Cav-1的Cav-1-/-小鼠,可以恢復與Cav-1+/+小鼠相同的對H2O2的敏感性,而重新表達Y14F-Cav-1的Cav-1-/-小鼠仍然未發(fā)生肺通透性增加和肺水腫。
　　 結(jié)論:(1)H2O2可誘導Cav-1的酪氨酸磷酸化。其中低濃度H2O2誘導的Ca

15、v-1磷酸化主要依賴于Src激酶,而高濃度H2O2誘導的Cav-1磷酸化同時依賴于Src和c-Abl激酶。(2)Cav-1的磷酸化介導了低濃度的H2O2誘導的白蛋白跨細胞通透性增加。(3)Cav-1的磷酸化介導了高濃度H2O2誘導的白蛋白細胞旁通透性增加。其機制主要是通過阻礙Cav-1與細胞連接蛋白β-catenin的結(jié)合,使β-catenin由細胞膜轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì),從而減少β-catenin和VE-cadherin的復合體,破環(huán)細胞連接

16、的穩(wěn)定性。(4)Cav-1的磷酸化介導了H2O2誘導的肺血管通透性增加和肺水腫。
　　 意義:本研究首次證明了磷酸化的Cav-1不僅參與了氧化劑誘導的血管內(nèi)皮跨細胞通透性增加,更重要的是其可以調(diào)節(jié)細胞間連接,在細胞旁通透性增加中也起關(guān)鍵作用。首次將導致通透性增加的兩條原本認為孤立的途徑用一個蛋白即磷酸化的Cav-1聯(lián)系起來。同時也揭示了,炎癥狀態(tài)下跨細胞通透性和細胞旁通透性之間可能存在協(xié)同關(guān)系。磷酸化的Cav-1可能是抑制氧化劑