MAP4在炎癥導(dǎo)致肺微血管通透性增高中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　嚴(yán)重?zé)齻?，由于?yīng)激刺激，神經(jīng)、體液和內(nèi)分泌紊亂，體內(nèi)常有致炎因子釋放，容易引起局部或全身的炎癥反應(yīng)(inflammation)。炎癥反應(yīng)發(fā)生后，炎性細(xì)胞又被進(jìn)一步激活，細(xì)胞和體液均可釋放大量的炎癥介質(zhì)，通過直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞或間接影響其它化學(xué)因子而最終引起血管通透性的增高。作為人體與外界溝通的重要門戶，肺在嚴(yán)重?zé)齻?，極易受到多種因素影響而引起肺微血管通透性增高，導(dǎo)致肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障破壞，進(jìn)而引起急性

2、肺損傷(acute lung injury，ALI)的發(fā)生。截至目前，臨床尚無有效降低血管通透性的方法，對(duì)于炎癥導(dǎo)致肺微血管通透性增高的機(jī)制我們也依然不清楚。
　　近年來，大量研究結(jié)果提示，微管(microtubule，MT)作為細(xì)胞骨架系統(tǒng)的重要成分，在內(nèi)皮細(xì)胞通透性的調(diào)節(jié)中具有舉足輕重的地位，而微管的穩(wěn)定受到其它多種因素的影響，例如GTP、溫度、藥物、微管相關(guān)蛋白等。相關(guān)研究表明，微管解聚可以引起細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)等一系

3、列改變，造成細(xì)胞不可逆的損傷。而微管穩(wěn)定劑則可穩(wěn)定微管，抑制這些破壞作用的發(fā)生。但是在炎癥條件下，微管是如何參與并調(diào)節(jié)人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human pulmonary microvascular endothelial cells，HPMECs)通透性的增高，我們尚不清楚。
　　因此，本研究將檢測(cè)MAP4在炎癥時(shí)的活性變化情況，并且通過構(gòu)建MAP4突變體MAP4(Ala)，模擬MAP4的去磷酸化狀態(tài)，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重組腺病毒，進(jìn)一

4、步明確MAP4磷酸化是否介導(dǎo)炎癥引起的HPMECs通透性增高。在此基礎(chǔ)之上，我們還將初步探索MAP4參與調(diào)節(jié)炎癥導(dǎo)致HPMECs通透性增高的相關(guān)機(jī)制。旨在為臨床相關(guān)疾病的治療提供新的靶點(diǎn)和研究方向。
　　材料和方法:
　　1、我們以HPMECs為研究對(duì)象，利用致炎因子脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-α)處理細(xì)胞，模擬體外炎癥刺激。觀察致炎

5、因子LPS(200、500、1000ng/ml)和TNF-α(200、500、1000ng/ml)處理前后，HPMECs通透性及微管的變化情況，并采用以下方法進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)和觀察:1）檢測(cè)FITC-dextran(40kDa)熒光物質(zhì)漏出情況和測(cè)量跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值(TER)，以此觀察肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的改變狀況;2）對(duì)α-微管蛋白進(jìn)行免疫熒光染色(Immunofluorescence，IF)，以此觀察微管的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和分布狀況;3）

6、將游離態(tài)與聚合態(tài)的微管蛋白分離、提取并定量，采用Western blot(WB)方法進(jìn)行檢測(cè)，觀察游離態(tài)與聚合態(tài)微管蛋白含量的變化情況。
　　2、使用微管穩(wěn)定劑紫杉醇(taxol，luM)預(yù)處理細(xì)胞，觀察紫杉醇預(yù)處理前后，致炎因子LPS(500ng/ml)和TNF-α(500ng/ml)刺激對(duì)HPMECs通透性和微管的影響。通過檢測(cè)FITC-dextran和TER，來觀察肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性的改變情況;采用IF法觀察微管的形

7、態(tài)、結(jié)構(gòu)和分布的改變;分離并提取游離態(tài)和聚合態(tài)的微管蛋白，通過WB檢測(cè)其含量的變化。
　　3、通過WB進(jìn)行檢測(cè)，觀察致炎因子LPS(500ng/ml)和TNF-α(500ng/ml)處理HPMECs1h、3h、6h、12h后，MAP4活性的變化情況。構(gòu)建模擬MAP4去磷酸化狀態(tài)的突變體MAP4(Ala)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HPMECs72h，通過測(cè)量FITC-dextran熒光漏出和TER，觀察轉(zhuǎn)染前后，致炎因子LPS(500ng/ml)和

8、TNF-α(500ng/ml)刺激對(duì)HPMECs通透性的影響，并采用IF法檢測(cè)微管的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和分布狀況，同時(shí)分離提取聚合態(tài)與游離態(tài)的微管蛋白，通過WB法檢測(cè)其含量的改變，另外，使用免疫共沉淀(Immunoprecipitation，IP)檢測(cè)MAP4與微管間的相互作用情況，以此明確MAP4在調(diào)節(jié)HPMECs通透性和微管改變中發(fā)揮的作用。
　　結(jié)果:
　　1、致炎因子LPS(200、500、1000ng/ml)或TNF-α(

9、200、500、1000ng/ml)處理HPMECs6h后，HPMECs單層對(duì)FITC-dextran熒光物質(zhì)漏出增多，跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值降低，并且呈劑量依賴性改變;致炎因子LPS或TNF-α刺激濃度為200ng/ml時(shí)，微管結(jié)構(gòu)不規(guī)則，少量微管斷裂; LPS或TNF-α刺激濃度為500ng/ml時(shí)，細(xì)胞膜周微管解聚明顯，細(xì)胞核周微管皺縮;當(dāng)LPS或TNF-α刺激濃度增至1000ng/ml時(shí)，只殘留極少的微管結(jié)構(gòu)和片段;游離/聚合態(tài)微管蛋

10、白定量檢測(cè)提示，致炎因子LPS(200、500、1000ng/ml)或TNF-α(200、500、1000ng/ml)處理后，游離態(tài)微管蛋白增多而聚合態(tài)微管蛋白減少，并呈劑量依賴性改變。
　　2、根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇LPS(500ng/ml)或TNF-α(500ng/ml)兩個(gè)典型的致炎因子用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在微管穩(wěn)定劑紫杉醇(1uM)預(yù)處理細(xì)胞1h后，正常細(xì)胞通透性無明顯改變，微管聚合增加，解聚減少;同時(shí)，致炎因子LPS(500n

11、g/ml)或TNF-α(500ng/ml)刺激6h導(dǎo)致的FITC-dextran熒光物質(zhì)漏出明顯減少，跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值明顯增加;并且微管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞減少，細(xì)胞膜周微管密度增加;聚合態(tài)微管蛋白含量增加，游離態(tài)微管蛋白含量減少。
　　3、致炎因子LPS(500ng/ml)或TNF-α(500ng/ml)處理HPMECs6h后，MAP4(S696與S787)磷酸化增高，而MAP4(Ser768)磷酸化無改變。轉(zhuǎn)染MAP4(Ala)干預(yù)M

12、AP4磷酸化后，正常HPMECs通透性無明顯改變，微管聚合增加，解聚減少;同時(shí)，致炎因子LPS(500ng/ml)或TNF-α(500ng/ml)刺激6h后的HPMECs單層對(duì)FITC-dextran熒光物質(zhì)漏出明顯減少，跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值明顯升高;而且微管的動(dòng)力學(xué)更加穩(wěn)定，微管的結(jié)構(gòu)得到改善，游離態(tài)的微管含量減少而聚合態(tài)微管蛋白增多;此外，MAP4與微管之間的相互結(jié)合也增多。
　　結(jié)論:
　　致炎因子LPS或TNF-α處理H