MSC旁分泌VEGF-HGF對(duì)ALI大鼠肺微血管內(nèi)皮通透性和肺損傷修復(fù)的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 VEGF/HGF穩(wěn)定低表達(dá)的MSC構(gòu)建及鑒定
　　目的:構(gòu)建血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)/肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)穩(wěn)定低表達(dá)的骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)。
　　方法:
　　(1)采用直接貼壁法從SD大鼠骨髓分離、純化獲得MSC，并通過(guò)流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)表面標(biāo)志物和誘導(dǎo)成脂、成骨、成軟骨分化以對(duì)其進(jìn)行鑒定;
　　(2)構(gòu)建攜帶VEGF或HGF基因干擾序列的慢病毒質(zhì)粒，設(shè)立只表達(dá)綠色熒光蛋白(Green

2、fluorescentprotein，GFP)的無(wú)意義序列作為空白對(duì)照質(zhì)粒，然后分別通過(guò)Polybrene與質(zhì)粒LV3（攜帶GFP&Puro）-NC，LV3（攜帶GFP&Puro）-VEGFA-Rat-1536和LV3(攜帶GFP&Puro)-HGF-Rat-591分別感染293T細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒的包裝，然后用所獲得的攜帶目的基因干擾序列的慢病毒轉(zhuǎn)染MSC，用嘌呤霉素(Puromycin)進(jìn)行藥物篩選，挑取克隆純化傳代培養(yǎng)10代后，熒光顯微

3、鏡下觀察報(bào)告基因GFP陽(yáng)性細(xì)胞，并拍照計(jì)數(shù)分析GFP陽(yáng)性細(xì)胞比率評(píng)估轉(zhuǎn)染效率;
　　(3)qRT-PCR(Quantitative real-timepolymerase chain reaction)法、Western blot法以及ELISA法分別檢測(cè)MSC內(nèi)VEGF或HGF mRNA水平、目的蛋白表達(dá)水平以及細(xì)胞外目的蛋白分泌水平以評(píng)估基因干擾效果;(4)體外劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)評(píng)估基因干擾對(duì)MSC水平和

4、垂直遷移能力的影響。
　　結(jié)果:
　　(1)分離純化后的MSC為成纖維細(xì)胞樣，SD大鼠骨髓來(lái)源的MSC表面表達(dá)CD90、CD44、CD34，陽(yáng)性率≥70％，而不表達(dá)CD29、CD45、CD11b/c，陽(yáng)性率≤5％，且可體外誘導(dǎo)分化為成脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞;
　　(2)慢病毒介導(dǎo)VEGF或HGF基因干擾的MSC，傳代培養(yǎng)10代后，熒光蛋白GFP的攜帶率仍高達(dá)90％以上;
　　(3)VEGF基因干擾后，MS

5、C內(nèi)VEGF mRNA水平明顯下降(P＜0.05)，VEGF蛋白表達(dá)水平明顯減低(P＜0.05)，MSC對(duì)VEGF的分泌亦明顯減少(P＜0.05);HGF基因干擾后，MSC內(nèi)HGF mRNA水平明顯下降(P＜0.05)，HGF蛋白表達(dá)水平明顯減低(P＜0.05)，MSC對(duì)HGF的分泌明顯減少(P＜0.05);
　　(4)與野生型MSC相比，VEGF/HGF基因干擾后MSC的水平和垂直遷移能力無(wú)明顯變化(P＞0.05)，提示從理論上

6、來(lái)說(shuō)，MSC-ShVEGF/MSC-ShVEGF具有與MSC同等的向損傷部位歸巢的能力。
　　結(jié)論:借助慢病毒載體介導(dǎo)的VEGF或HGF基因干擾技術(shù)，成功構(gòu)建了對(duì)VEGF/HGF穩(wěn)定低表達(dá)且仍具備向損傷組織歸巢能力的MSC細(xì)胞株，從而為進(jìn)一步在體實(shí)驗(yàn)明確旁分泌VEGF/HGF在MSC改善ALI肺微血管通透性和促進(jìn)肺損傷修復(fù)中的作用和機(jī)制奠定了可靠的基礎(chǔ)。
　　第二部分 MSC旁分泌VEGF對(duì)ALI大鼠肺微血管內(nèi)皮通透性和肺損

7、傷修復(fù)的影響
　　目的:研究MSC旁分泌VEGF對(duì)ALI大鼠肺微血管內(nèi)皮通透性和肺損傷修復(fù)的影響。
　　方法:SD大鼠隨機(jī)分為NS+PBS組（正常對(duì)照組），LPS+PBS組（ALI組），LPS+MSC組(MSC治療組)，LPS+MSC-GFP組（MSC-GFP治療組），LPS+MSC-ShVEGF組(VEGF基因干擾的MSC治療組)，氣道內(nèi)滴入LPS復(fù)制大鼠ALI動(dòng)物模型，按分組經(jīng)不同處理后，1h、6h和24h處死大鼠并留取

8、肺組織標(biāo)本。
　　①計(jì)算肺濕重與體重比(LWW/BW)以及伊文思蘭實(shí)驗(yàn)評(píng)估肺水腫和肺血管通透性情況;
　　②免疫熒光染色評(píng)估MSC移植后24小時(shí)肺組織中黏附連接蛋白VE-Cadherin的表達(dá)水平;
　?、跿UNEL染色檢測(cè)MSC移植后24小時(shí)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況;
　　④HE染色行組織病理學(xué)檢查和肺損傷評(píng)分評(píng)價(jià)肺損傷程度;
　?、軪LISA檢測(cè)肺部炎癥因子IL-1β和IL-10水平評(píng)價(jià)肺部炎癥程度;

9、r>　　⑥ELISA檢測(cè)肺組織VEGF蛋白水平。
　　結(jié)果:
　?、費(fèi)SC-ShVEGF移植對(duì)ALI肺微血管通透性的影響:與MSC或MSC-GFP組相比，MSC-ShVEGF組LWW/BW在MSC移植治療后24小時(shí)明顯升高(P＜0.05)，MSC-ShVEGF組對(duì)伊文思蘭的通透性在MSC移植治療后6小時(shí)和24小時(shí)均明顯升高(P＜0.05);
　?、贛SC-ShVEGF移植對(duì)ALI肺組織細(xì)胞間黏附連接蛋白VE-cadhe

10、rin表達(dá)水平盼影響:與MSC或MSC-GFP組相比，MSC-ShVEGF組肺組織細(xì)胞間黏附連接蛋白VE-cadherin表達(dá)水平在MSC移植治療后24小時(shí)明顯下降(P＜0.05);
　?、跰SC-ShVEGF移植對(duì)ALI肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響:與MSC或MSC-GFP組相比，MSC-ShVEGF組肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡在MSC移植治療后24小時(shí)明顯增加(P＜0.05);
　?、躆SC-ShVEGF移植對(duì)ALI肺組織病理的影響

11、:與MSC或MSC-GFP組相比，MSC-ShVEGF組肺組織病理?yè)p傷和肺損傷評(píng)分在MSC移植治療后24小時(shí)明顯升高(P＜0.05);
　　⑤MSC-ShVEGF移植對(duì)ALI肺部炎癥的影響:與MSC或MSC-GFP組相比，MSC-ShVEGF組肺部促炎因子IL-1β的表達(dá)水平明顯增高，而抑炎因子IL-10的水平明顯降低(P＜0.05);
　?、轒SC-ShVEGF移植對(duì)ALI肺組織VEGF表達(dá)水平的影響:與MSC或MSC-G

12、FP組相比，MSC-ShVEGF組肺組織中VEGF的表達(dá)水平在MSC移植治療后24小時(shí)明顯降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　①M(fèi)SC通過(guò)旁分泌VEGF有利于穩(wěn)定LPS誘導(dǎo)的ALI大鼠肺組織細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)、減少肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡從而降低肺組織肺血管通透性，調(diào)節(jié)肺部炎癥反應(yīng)失衡，減輕肺組織病理?yè)p傷;
　?、谶@些肺保護(hù)效應(yīng)可能是MSC通過(guò)旁分泌VEGF糾正ALI肺部VEGF水平而實(shí)現(xiàn)的。
　　第三部分 MSC旁分

13、泌HGF對(duì)ALI大鼠肺微血管內(nèi)皮通透性和肺損傷修復(fù)的影響
　　目的:研究MSC旁分泌HGF對(duì)ALI大鼠肺微血管內(nèi)皮通透性和肺損傷修復(fù)的影響。
　　方法:SD大鼠隨機(jī)分為NS+PBS組（正常對(duì)照組），LPS+PBS組（ALI組），LPS+MSC組（MSC治療組），LPS+MSC-GFP組（MSC-GFP治療組），LPS+MSC-ShHGF組(HGF基因干擾的MSC治療組)，氣道內(nèi)滴入LPS復(fù)制ALI大鼠動(dòng)物模型，按分組經(jīng)不同處

14、理后，1h、6h、24h和48h處死大鼠并留取肺組織標(biāo)本。
　　①計(jì)算肺濕重與體重比以及伊文思蘭實(shí)驗(yàn)評(píng)估肺水腫程度和肺血管通透性情況;
　?、贖E染色行肺組織病理學(xué)檢查和肺損傷評(píng)分評(píng)價(jià)肺損傷程度;
　?、勖庖邿晒馊旧ㄎ辉u(píng)估MSC移植后24小時(shí)肺組織中黏附連接蛋白VE-Cadherin的表達(dá)情況;
　　④TUNEL染色檢測(cè)MSC移植后24小時(shí)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況;
　?、軪LISA檢測(cè)肺部炎癥因子IL廣1

15、β和IL-10水平評(píng)價(jià)肺部炎癥程度;
　　⑥免疫組化檢測(cè)MSC移植后24小時(shí)肺組織MSC的存留情況;
　?、逧LISA檢測(cè)肺組織HGF蛋白水平。
　　結(jié)果:
　?、費(fèi)SC-ShHGF移植對(duì)ALI肺微血管通透性的影響:與MSC或MSC-GFP組相比，MSC-ShHGF組LWW/BW在MSC移植治療后24小時(shí)明顯升高(P＜0.05)，MSC-ShHGF組肺血管對(duì)伊文思蘭的通透性在MSC移植治療后6小時(shí)和24小時(shí)均明顯

16、升高(P＜0.05);
　?、贛SC-ShHGF移植對(duì)ALI肺組織細(xì)胞間黏附連接蛋白VE-cadherin表達(dá)水平的影響:與MSC或MSC-GFP組相比，MSC-ShHGF組肺組織細(xì)胞間黏附連接蛋白VE-cadherin表達(dá)在MSC移植治療后24小時(shí)明顯減少(P＜0.05);
　?、跰SC-ShHGF移植對(duì)ALI肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響:與MSC或MSC-GFP組相比，MSC-ShHGF組肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡在MSC移植治療后

17、24小時(shí)明顯增加(P＜0.05);
　?、躆SC-ShHGF移植對(duì)ALI肺組織病理的影響:與MSC或MSC-GFP組相比，MSC-ShHGF組肺組織病理和肺損傷評(píng)分在MSC移植治療后24小時(shí)明顯升高(P＜0.05);
　?、軲SC-ShHGF移植對(duì)ALI肺部炎癥的影響:與MSC或MSC-GFP組相比，MSC-ShHGF組肺組織促炎因子IL-1β的表達(dá)水平明顯增高，而抑炎因子IL-10的水平明顯降低(P＜0.05);
　

18、?、轒SC-ShHGF移植后24小時(shí)MSC在損傷肺組織的存留情況:與MSC或MSC-GFP組相比，MSC-ShHGF組肺部MSC的存留在MSC移植治療后24小時(shí)無(wú)明顯改變(P＞0.05);
　?、進(jìn)SC-ShHGF移植對(duì)ALI肺組織HGF表達(dá)水平的影響:與MSC或MSC-GFP組相比，MSC-ShHGF組肺部HGF的表達(dá)水平在MSC移植治療后24小時(shí)和48小時(shí)明顯降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　?、費(fèi)SC旁分泌H