MSC旁分泌VEGF-HGF對ALI大鼠肺微血管內(nèi)皮通透性和肺損傷修復(fù)的作用及機制研究.pdf

1、第一部分 VEGF/HGF穩(wěn)定低表達的MSC構(gòu)建及鑒定
　　目的:構(gòu)建血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)/肝細胞生長因子(HGF)穩(wěn)定低表達的骨髓來源的間充質(zhì)干細胞(MSC)。
　　方法:
　　(1)采用直接貼壁法從SD大鼠骨髓分離、純化獲得MSC，并通過流式細胞學(xué)檢測表面標志物和誘導(dǎo)成脂、成骨、成軟骨分化以對其進行鑒定;
　　(2)構(gòu)建攜帶VEGF或HGF基因干擾序列的慢病毒質(zhì)粒，設(shè)立只表達綠色熒光蛋白(Green

2、fluorescentprotein，GFP)的無意義序列作為空白對照質(zhì)粒，然后分別通過Polybrene與質(zhì)粒LV3（攜帶GFP&Puro）-NC，LV3（攜帶GFP&Puro）-VEGFA-Rat-1536和LV3(攜帶GFP&Puro)-HGF-Rat-591分別感染293T細胞進行質(zhì)粒的包裝，然后用所獲得的攜帶目的基因干擾序列的慢病毒轉(zhuǎn)染MSC，用嘌呤霉素(Puromycin)進行藥物篩選，挑取克隆純化傳代培養(yǎng)10代后，熒光顯微

3、鏡下觀察報告基因GFP陽性細胞，并拍照計數(shù)分析GFP陽性細胞比率評估轉(zhuǎn)染效率;
　　(3)qRT-PCR(Quantitative real-timepolymerase chain reaction)法、Western blot法以及ELISA法分別檢測MSC內(nèi)VEGF或HGF mRNA水平、目的蛋白表達水平以及細胞外目的蛋白分泌水平以評估基因干擾效果;(4)體外劃痕實驗及Transwell小室遷移實驗評估基因干擾對MSC水平和

4、垂直遷移能力的影響。
　　結(jié)果:
　　(1)分離純化后的MSC為成纖維細胞樣，SD大鼠骨髓來源的MSC表面表達CD90、CD44、CD34，陽性率≥70％，而不表達CD29、CD45、CD11b/c，陽性率≤5％，且可體外誘導(dǎo)分化為成脂肪細胞、成骨細胞和成軟骨細胞;
　　(2)慢病毒介導(dǎo)VEGF或HGF基因干擾的MSC，傳代培養(yǎng)10代后，熒光蛋白GFP的攜帶率仍高達90％以上;
　　(3)VEGF基因干擾后，MS

5、C內(nèi)VEGF mRNA水平明顯下降(P＜0.05)，VEGF蛋白表達水平明顯減低(P＜0.05)，MSC對VEGF的分泌亦明顯減少(P＜0.05);HGF基因干擾后，MSC內(nèi)HGF mRNA水平明顯下降(P＜0.05)，HGF蛋白表達水平明顯減低(P＜0.05)，MSC對HGF的分泌明顯減少(P＜0.05);
　　(4)與野生型MSC相比，VEGF/HGF基因干擾后MSC的水平和垂直遷移能力無明顯變化(P＞0.05)，提示從理論上

6、來說，MSC-ShVEGF/MSC-ShVEGF具有與MSC同等的向損傷部位歸巢的能力。
　　結(jié)論:借助慢病毒載體介導(dǎo)的VEGF或HGF基因干擾技術(shù)，成功構(gòu)建了對VEGF/HGF穩(wěn)定低表達且仍具備向損傷組織歸巢能力的MSC細胞株，從而為進一步在體實驗明確旁分泌VEGF/HGF在MSC改善ALI肺微血管通透性和促進肺損傷修復(fù)中的作用和機制奠定了可靠的基礎(chǔ)。
　　第二部分 MSC旁分泌VEGF對ALI大鼠肺微血管內(nèi)皮通透性和肺損

7、傷修復(fù)的影響
　　目的:研究MSC旁分泌VEGF對ALI大鼠肺微血管內(nèi)皮通透性和肺損傷修復(fù)的影響。
　　方法:SD大鼠隨機分為NS+PBS組（正常對照組），LPS+PBS組（ALI組），LPS+MSC組(MSC治療組)，LPS+MSC-GFP組（MSC-GFP治療組），LPS+MSC-ShVEGF組(VEGF基因干擾的MSC治療組)，氣道內(nèi)滴入LPS復(fù)制大鼠ALI動物模型，按分組經(jīng)不同處理后，1h、6h和24h處死大鼠并留取

8、肺組織標本。
　?、儆嬎惴螡裰嘏c體重比(LWW/BW)以及伊文思蘭實驗評估肺水腫和肺血管通透性情況;
　?、诿庖邿晒馊旧u估MSC移植后24小時肺組織中黏附連接蛋白VE-Cadherin的表達水平;
　?、跿UNEL染色檢測MSC移植后24小時肺血管內(nèi)皮細胞凋亡情況;
　　④HE染色行組織病理學(xué)檢查和肺損傷評分評價肺損傷程度;
　?、軪LISA檢測肺部炎癥因子IL-1β和IL-10水平評價肺部炎癥程度;

9、r>　　⑥ELISA檢測肺組織VEGF蛋白水平。
　　結(jié)果:
　　①MSC-ShVEGF移植對ALI肺微血管通透性的影響:與MSC或MSC-GFP組相比，MSC-ShVEGF組LWW/BW在MSC移植治療后24小時明顯升高(P＜0.05)，MSC-ShVEGF組對伊文思蘭的通透性在MSC移植治療后6小時和24小時均明顯升高(P＜0.05);
　?、贛SC-ShVEGF移植對ALI肺組織細胞間黏附連接蛋白VE-cadhe

10、rin表達水平盼影響:與MSC或MSC-GFP組相比，MSC-ShVEGF組肺組織細胞間黏附連接蛋白VE-cadherin表達水平在MSC移植治療后24小時明顯下降(P＜0.05);
　　③MSC-ShVEGF移植對ALI肺血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響:與MSC或MSC-GFP組相比，MSC-ShVEGF組肺血管內(nèi)皮細胞凋亡在MSC移植治療后24小時明顯增加(P＜0.05);
　?、躆SC-ShVEGF移植對ALI肺組織病理的影響

11、:與MSC或MSC-GFP組相比，MSC-ShVEGF組肺組織病理損傷和肺損傷評分在MSC移植治療后24小時明顯升高(P＜0.05);
　　⑤MSC-ShVEGF移植對ALI肺部炎癥的影響:與MSC或MSC-GFP組相比，MSC-ShVEGF組肺部促炎因子IL-1β的表達水平明顯增高，而抑炎因子IL-10的水平明顯降低(P＜0.05);
　?、轒SC-ShVEGF移植對ALI肺組織VEGF表達水平的影響:與MSC或MSC-G

12、FP組相比，MSC-ShVEGF組肺組織中VEGF的表達水平在MSC移植治療后24小時明顯降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　?、費SC通過旁分泌VEGF有利于穩(wěn)定LPS誘導(dǎo)的ALI大鼠肺組織細胞間連接結(jié)構(gòu)、減少肺血管內(nèi)皮細胞凋亡從而降低肺組織肺血管通透性，調(diào)節(jié)肺部炎癥反應(yīng)失衡，減輕肺組織病理損傷;
　　②這些肺保護效應(yīng)可能是MSC通過旁分泌VEGF糾正ALI肺部VEGF水平而實現(xiàn)的。
　　第三部分 MSC旁分

13、泌HGF對ALI大鼠肺微血管內(nèi)皮通透性和肺損傷修復(fù)的影響
　　目的:研究MSC旁分泌HGF對ALI大鼠肺微血管內(nèi)皮通透性和肺損傷修復(fù)的影響。
　　方法:SD大鼠隨機分為NS+PBS組（正常對照組），LPS+PBS組（ALI組），LPS+MSC組（MSC治療組），LPS+MSC-GFP組（MSC-GFP治療組），LPS+MSC-ShHGF組(HGF基因干擾的MSC治療組)，氣道內(nèi)滴入LPS復(fù)制ALI大鼠動物模型，按分組經(jīng)不同處

14、理后，1h、6h、24h和48h處死大鼠并留取肺組織標本。
　?、儆嬎惴螡裰嘏c體重比以及伊文思蘭實驗評估肺水腫程度和肺血管通透性情況;
　?、贖E染色行肺組織病理學(xué)檢查和肺損傷評分評價肺損傷程度;
　　③免疫熒光染色定位評估MSC移植后24小時肺組織中黏附連接蛋白VE-Cadherin的表達情況;
　?、躎UNEL染色檢測MSC移植后24小時肺血管內(nèi)皮細胞凋亡情況;
　?、軪LISA檢測肺部炎癥因子IL廣1

15、β和IL-10水平評價肺部炎癥程度;
　?、廾庖呓M化檢測MSC移植后24小時肺組織MSC的存留情況;
　?、逧LISA檢測肺組織HGF蛋白水平。
　　結(jié)果:
　?、費SC-ShHGF移植對ALI肺微血管通透性的影響:與MSC或MSC-GFP組相比，MSC-ShHGF組LWW/BW在MSC移植治療后24小時明顯升高(P＜0.05)，MSC-ShHGF組肺血管對伊文思蘭的通透性在MSC移植治療后6小時和24小時均明顯

16、升高(P＜0.05);
　?、贛SC-ShHGF移植對ALI肺組織細胞間黏附連接蛋白VE-cadherin表達水平的影響:與MSC或MSC-GFP組相比，MSC-ShHGF組肺組織細胞間黏附連接蛋白VE-cadherin表達在MSC移植治療后24小時明顯減少(P＜0.05);
　?、跰SC-ShHGF移植對ALI肺血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響:與MSC或MSC-GFP組相比，MSC-ShHGF組肺血管內(nèi)皮細胞凋亡在MSC移植治療后

17、24小時明顯增加(P＜0.05);
　?、躆SC-ShHGF移植對ALI肺組織病理的影響:與MSC或MSC-GFP組相比，MSC-ShHGF組肺組織病理和肺損傷評分在MSC移植治療后24小時明顯升高(P＜0.05);
　　⑤MSC-ShHGF移植對ALI肺部炎癥的影響:與MSC或MSC-GFP組相比，MSC-ShHGF組肺組織促炎因子IL-1β的表達水平明顯增高，而抑炎因子IL-10的水平明顯降低(P＜0.05);
　

18、?、轒SC-ShHGF移植后24小時MSC在損傷肺組織的存留情況:與MSC或MSC-GFP組相比，MSC-ShHGF組肺部MSC的存留在MSC移植治療后24小時無明顯改變(P＞0.05);
　　⑦MSC-ShHGF移植對ALI肺組織HGF表達水平的影響:與MSC或MSC-GFP組相比，MSC-ShHGF組肺部HGF的表達水平在MSC移植治療后24小時和48小時明顯降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　?、費SC旁分泌H