膿毒癥急性肺損傷時HSPA12B對肺血管通透性的影響及其機制.pdf

1、膿毒癥是臨床上常見的、嚴重威脅病人生命的感染性綜合征，進一步發(fā)展導(dǎo)致膿毒癥休克、多器官功能損傷，發(fā)病率及死亡率高。其中，急性肺損傷(ALI)是膿毒癥最常見的并發(fā)癥之一，其發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機制是肺內(nèi)皮屏障功能障礙，肺血管通透性增加，進一步導(dǎo)致肺水腫、嚴重低氧血癥。肺血管通透性增加是其主要的病理生理特征。因此，保護肺血管內(nèi)皮細胞、維持正常的肺內(nèi)皮屏障功能及肺血管通透性對于ALI的干預(yù)治療具有重要的臨床意義。
　　熱休克蛋白A12B(HS

2、PA12B)是HSP70超家族中的一員，不同于其他熱休克蛋白，它主要表達于血管內(nèi)皮細胞，是內(nèi)皮細胞特異的熱休克蛋白，參與了血管的生成與穩(wěn)定。HSPA12B表達上調(diào)可以減輕膿毒癥導(dǎo)致的心功能障礙，也可以減輕缺血再灌注時腦組織的損傷。但是，HSPA12B對膿毒癥時肺臟功能有無保護作用，尤其是對肺內(nèi)皮通透性有無影響及其可能的機制，尚未見研究。
　　本研究通過離體與在體實驗，探討膿毒癥時HSPA12B對內(nèi)皮細胞通透性的影響及其可能的機制。

3、離體實驗，采用脂多糖(LPS)刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)，研究HSPA12B的表達變化情況及其發(fā)生變化的可能機制;構(gòu)建HSPA12B過表達質(zhì)粒，研究HSPA12B過表達對血管內(nèi)皮細胞通透性的影響以及其作用機制。在體實驗，采用鼻吸入經(jīng)修飾的siRNA納米微粒復(fù)合物的方法使小鼠的HSPA12B表達下調(diào)，然后構(gòu)建CLP小鼠模型，頸外靜脈注射EvansBlue dye，檢測肺組織中Evans Blue dye含量以反應(yīng)HSPA12B表達

4、下調(diào)對膿毒癥小鼠肺通透性的影響。
　　第一部分 LPS處理HUVEC時HSPA12B的表達變化及其可能機制
　　目的:探討HSPA12B在LPS處理的HUVEC中的表達變化及其機制。
　　方法:
　　1.培養(yǎng)HUVEC，用終濃度為1μg/ml的LPS刺激HUVEC，分別于0h、3h、6h、9h、12h、24h收集細胞，應(yīng)用RT-PCR法及Western blot法分別檢測HSPA12B的mRNA及蛋白質(zhì)水平。

5、r>　　2.培養(yǎng)HUVEC，分別用NF-κB、p38抑制劑(NF-κB inhibitor、SB203580)及其對照試劑DMSO對細胞進行預(yù)處理，然后用LPS刺激HUVEC，12h后收集細胞，Western blot法檢測HSPA12B的蛋白質(zhì)水平。
　　結(jié)果:
　　1.LPS處理HUVEC后，HSPA12B mRNA和蛋白質(zhì)水平均在0-12h內(nèi)逐漸升高，12h達高峰。
　　2.與DMSO相比，使用NF-κB inh

6、ibitor、SB203580后可以降低LPS誘導(dǎo)的HSPA12B的蛋白質(zhì)表達水平。
　　結(jié)論：內(nèi)毒素對HUVEC中HSPA12B表達具有一定影響，HSPA12B的表達在0-12h內(nèi)逐漸升高，12h達高峰，隨后開始下降;LPS誘導(dǎo)的HSPA12B表達的改變與NF-κB、p38信號通路相關(guān)。
　　第二部分 HSPA12B對LPS誘導(dǎo)HUVEC通透性改變的影響
　　目的：研究HSPA12B表達上調(diào)對LPS誘導(dǎo)的HUVEC通

7、透性改變的影響。
　　方法：HUVEC分為4組:①control組（未進行任何處理）;②LPS（1μg/ml）組;③LPS+HSPA12B高表達組（轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pIRES2-EGFP-3Flag-HSPA12B）;④LPS+陰性對照質(zhì)粒組（轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-3Flag）。分別進行相應(yīng)的處理后，檢測HUVEC的跨內(nèi)皮電阻抗(TEER)值。
　　結(jié)果：control組、LPS組、(LPS+HSPA12B高表達)組、（LPS

8、+陰性對照質(zhì)粒）組的TEER值分別為:36±2Ω、25±1Ω、28±1Ω、45±2Ω。與LPS組和(LPS+陰性對照質(zhì)粒)組比較，HSPA12B高表達組的TEER值均明顯升高。
　　結(jié)論：HSPA12B可以降低LPS刺激下HUVEC的通透性，可能對血管內(nèi)皮屏障功能有保護作用。
　　第三部分 HSPA12B影響HUVEC通透性的可能機制
　　目的：探討HSPA12B對LPS刺激下HUVEC通透性的影響機制。
　　方

9、法：將HUVEC分為四組:①control組（未進行任何處理）;②LPS（1μg/ml）組;③LPS+HSPA12B高表達組（轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pIRES2-EGFP-3Flag-HSPA12B）;④LPS+陰性對照質(zhì)粒組（轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-3Flag）。LPS處理12h后收集細胞，Westernblot法檢測粘附分子VE-cadherin、ICAM-1、E-selectin的表達，以及通透性相關(guān)激酶MLC、SRC、cdc42的表達及其

10、活性;免疫熒光檢測VE-cadherin的表達水平。
　　結(jié)果：Western blot檢測結(jié)果表明:HUVEC經(jīng)LPS刺激12h后，與轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒組相比，HSPA12B高表達組的粘附分子VE-cadherin表達水平明顯上調(diào);HSPA12B高表達組的激酶MLC、SRC、cdc42的表達也增強，而其活性形式P-MLC、P-SRC、P-CDC42水平并無差異。免疫熒光結(jié)果顯示，HSPA12B高表達組的VE-cadherin水平也

11、升高。
　　結(jié)論：結(jié)合第二部分的實驗結(jié)果，本部分結(jié)果提示:LPS刺激下，HSAP12B可能通過上調(diào)粘附分子VE-cadherin的表達，降低HUVEC的通透性;也可能通過增加血管內(nèi)皮通透性相關(guān)的激酶MLC、SRC、CDC42的表達，降低HUVEC的通透性，從而起到保護血管內(nèi)皮屏障功能的作用。
　　第四部分 HSPA12B對膿毒癥肺損傷小鼠肺通透性的影響
　　目的：在體研究HSPA12B表達下調(diào)對膿毒癥急性肺損傷小鼠肺通

12、透性的影響。
　　方法：實驗小鼠隨機分為四組:sham組、CLP組、NC-CLP組、HSP12B-siRNA-CLP組。小鼠經(jīng)鼻吸入修飾的siRNA納米微粒復(fù)合物，CLP術(shù)后30h，經(jīng)頸外靜脈注射Evans Blue，2h后取肺組織檢測EB染料的含量。
　　結(jié)果：肺組織大體觀顯示:較NC-CLP組，HSPA12B-siRNA-CLP組小鼠肺組織明顯變藍。肺組織Evans藍的含量檢測結(jié)果顯示，sham組、CLP組、NC-CLP

13、組、HSP12B-siRNA-CLP組小鼠肺組織EBD的含量分別為:10.28±0.72μg/g、12.22±0.37μg/g、11.97±0.79μg/g、15.65±2.36μg/g。與NC-CLP組相比，HSPA12B-siRNA-CLP組小鼠肺組織Evans藍的含量明顯增多。
　　結(jié)論：HSPA12B表達下調(diào)后小鼠肺組織Evans藍含量明顯增多，表明肺通透性增加，肺血屏障功能受損。提示:膿毒癥急性肺損傷時，HSPA12B高