內(nèi)皮祖細(xì)胞對兔急性肺損傷肺血管通透性的影響.pdf

1、背景:急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)與內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelialcells，EC)損傷密切相關(guān)。在急性肺損傷的發(fā)生、發(fā)展過程中肺血管內(nèi)皮細(xì)胞是受損的主要靶細(xì)胞，也是活躍的炎癥細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞。而內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一類能整合到血管、替代受損血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，它可以產(chǎn)生一些生長因子和細(xì)胞因子修復(fù)受損的內(nèi)皮層，從而促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)和血管新生。

2、>　　 目的:本研究的目的是通過體外分離、培養(yǎng)同種外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)，并對其進(jìn)行簡單鑒定。將培養(yǎng)獲得的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)注射到實驗組動物體內(nèi)，觀察其對油酸所致兔急性肺損傷肺毛細(xì)血管內(nèi)皮的修復(fù)作用，并分別檢測肺組織濕干重比(W/D)、肺泡灌洗液蛋白含量及肺毛細(xì)血管通透指數(shù)(PPI)，并對各組動物進(jìn)行DAD病理評分，觀察實驗組、對照組與空白組，以及實驗組和對照組動物上述指標(biāo)的變化，從而評估自體外周血來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞對兔急性肺

3、損傷肺毛細(xì)血管通透性的影響。探討內(nèi)皮祖細(xì)胞對急性肺損傷動物的保護(hù)作用，從而為細(xì)胞學(xué)治療方法提供動物模型依據(jù)，為急性肺損傷的臨床治療提供一種新的思路。
　　 方法:(1)內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定:造模前（一周）肝素抗凝管自兔耳中央動脈取血(10mL/Kg)，以Ficoll液密度梯度法分離出單個核細(xì)胞(PMC)，并將其接種于6孔板內(nèi)，應(yīng)用內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)基(EGM2)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每3天換全液，用PBS洗去非貼壁細(xì)胞。培養(yǎng)至第7天的貼壁

4、細(xì)胞用于細(xì)胞移植和雙熒光染色鑒定。在激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope，LSCM)下，DiI-ac-LDL和FITC-UEA-I雙染色陽性的細(xì)胞即為正在分化的內(nèi)皮組細(xì)胞(EPCs)。(2)實驗動物分組及模型建立:將體重為2.5-3.0Kg的普通級雄性新西蘭白兔30只隨機(jī)分為3組，每組10只，并對3組中的每只動物分別進(jìn)行標(biāo)記，以便數(shù)據(jù)的記錄。①空白組即空白對照組(blankcontr

5、ol group):經(jīng)頸靜脈注射乳化液(0.3ml/kg);②對照組即單純急性肺損傷組，經(jīng)頸內(nèi)靜脈注射20％乳化油酸(0.3ml/kg)建立急性肺損傷動物模型;③實驗組即EPCs治療組，經(jīng)與對照組同種方式造模成功30min后，經(jīng)耳緣靜脈注射105個/0.5ml PBS;空白組和對照組注射等量的PBS。48小時后處死全部動物。所有動物處死前均經(jīng)耳緣靜脈抽取靜脈血2ml，用于檢測血漿蛋白含量。并取出全部肺組織，切取右肺稱重，即為濕重，然后進(jìn)

6、行肺泡灌洗，收集全部灌洗液用以檢測肺泡灌洗液中蛋白含量，結(jié)合血漿蛋白含量計算肺毛細(xì)血管通透指數(shù)(PPI);然后將其（右肺）置于90℃烤箱中過夜，并稱重，即為干重。取左肺用4％的多聚甲醛溶液固定，常規(guī)蘇木素伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變并攝片。病理醫(yī)師單盲讀片，鏡下觀察肺內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤及出血情況，按修正后彌漫性肺泡損傷(DAD)系統(tǒng)進(jìn)行評分。通過觀察和檢測對照組、實驗組與空白組動物的呼吸頻率、肺濕干重比值(W/D)、肺泡灌洗

7、液蛋白含量、肺毛細(xì)血管通透指數(shù)(PPI)及肺組織病理檢查等指標(biāo)在實驗干預(yù)前、后的變化，并將三組動物各種觀察指標(biāo)進(jìn)行比較分析。
　　 結(jié)果:(1)呼吸頻率:實驗之前三組動物的呼吸頻率無顯著差異;實驗后:對照組呼吸頻率顯著高于其實驗前及空白組的呼吸頻率，實驗組（經(jīng)EPCs治療后）呼吸頻率較對照組明顯改善，但較空白組呼吸亦有增快，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);(2)濕干重比(W/D):對照組W/D較空白組顯著增高，而實驗組W/D

8、較對照組的明顯降低(p＜0.05)，實驗組較空白組增加，差異顯著(p＜0.05);(3)肺泡灌洗液蛋白含量:對照組肺泡灌洗液的蛋白含量顯著高于空白組，而實驗組較對照組降低，實驗組較空白組增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);(4)肺血管通透性指數(shù)(PPI):對照組PPI顯著高于空白組，實驗組PPI與對照組相比明顯降低，實驗組較空白組增大，差異顯著(P＜0.05);(5)病理檢測:肺組織大體觀可見，與空白組肺組織對比，實驗組和對照組肺

9、組織腫脹，重量增加，暗紅色，見散在出血點，切面膨隆，含血量多。光學(xué)顯微鏡下可見，肺組織病理學(xué)改變，空白組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔規(guī)則而完整，未見中性粒細(xì)胞浸潤。對照組病理切片可見肺間質(zhì)高度充血、水腫，大部分肺泡結(jié)構(gòu)破壞鄰近肺泡隔斷裂形成肺大泡，肺泡間隔明顯增寬，并可見較多炎性細(xì)胞，毛細(xì)血管擴(kuò)張，充血，灶狀出血，DAD病理評分顯著高于空白組。實驗組可見肺組織結(jié)構(gòu)仍有破壞，肺泡問質(zhì)輕度充血，大部分肺泡結(jié)構(gòu)完整，DAD病理評分顯著低于對照組。<