VEGF121和VEGF165對血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性影響的研究.pdf

1、目的:血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)發(fā)現(xiàn)于1989年,是一種能特異的作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子,具有促血管生成等活性。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)家族成員包括:VEGF-A、VEGF-B、胎盤生長因(PIGF)、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和它們的受體VEGFR-1、2、3及Neuropilins,VEGF受體特異性地分布于血管內(nèi)皮等細(xì)胞

2、,VEGF通過與其受體的結(jié)合而發(fā)揮促進(jìn)血管新生和增強血管通透性的生理功能。在人類,VEGF-A占主導(dǎo)作用,其共有8種亞型,包括:VEGF121,VEGF145,VEGF148,VEGF165,VEGF165b,VEGF183,VEGF189和VEGF206,其中VEGF121和VEGF165是主要的分泌亞型。
　　 一氧化氮(Nitric oxide,NO)廣泛分布于動物和植物的體內(nèi),具有多種的生理病理學(xué)功能,是作用最強的舒血管

3、物質(zhì)之一。NO作為信號傳導(dǎo)因子與鳥苷酸環(huán)化酶結(jié)合,使之活化,cGMP含量升高,cGMP可降低血管平滑肌中的Ca2+的濃度,引起血管平滑肌舒張,血管擴張、血管通透新增加。
　　 血管新生(Angiogenesis)及通透性增加在腫瘤、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、心血管疾病、糖尿病并發(fā)癥等疾病發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用,而血管新生與VEGF有著密切的關(guān)系。近年研究發(fā)現(xiàn),在諸多皮膚病如特應(yīng)性皮炎、銀屑病、尖銳濕疣等的皮損和血清中VEGF水平均高于正常

4、,所以認(rèn)為其與這些皮膚病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),因此,研究血管內(nèi)皮生長因子在皮膚病的表達(dá)及其在病理過程中所發(fā)揮的作用,不僅有助于闡明諸多皮膚病的發(fā)病機制,而且可通過對其作用靶點的研究,將為今后進(jìn)一步探討其治療措施提供新的思路。
　　 VEGF121和VEGFl65是皮膚組織主要的表達(dá)亞型,兩者參與各種病理生理過程,以往的各種研究主要著眼于VEGF-A的研究,具體到亞型的很少,所以,本研究旨在通過研究兩種不同亞型的VEGF對血管內(nèi)皮細(xì)

5、胞通透性影響,以及不同亞型VEGF刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞后NO釋放量的測定,明確引起血管通透性增加的主要VEGF亞型,從而為研發(fā)VEGF阻斷劑,靶向治療存在VEGF異常表達(dá)的皮膚病提供可靠的理論依據(jù),同時可將毒副作用降到最低。
　　 方法:
　　 1、人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的體外培養(yǎng)
　　 EGM-2完全培養(yǎng)基37℃、5％CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng),2-3天更換一次培養(yǎng)基。
　　 2、雙腔通透性測定試劑盒(

6、In Vitro Vascular Permeability Assay kit;ECM640)建立通透性檢測模型,濃度為25ng/ml的VEGF121或VEGF165刺激人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 3、熒光酶標(biāo)儀(Exmission:490 nm,Emission:520nm)測定底層培養(yǎng)基中不同時間FITC-dextran量的變化。
　　 4、人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng),濃度為25ng/ml的VEGF121或VEG

7、F165刺激人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,Griess法測定不同時間培養(yǎng)基中NO含量。
　　 5、制圖,運用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS13.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　 結(jié)果:
　　 1、經(jīng)VEGF165或VEGF121刺激人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,通透性物質(zhì)(FITC-dextran)測定
　　 1.1熒光酶標(biāo)儀測定不同刺激時相的通透性物質(zhì)(FITC-dextran)的量,應(yīng)用重復(fù)測量的方差分析,在不同刺激物之間培養(yǎng)基中F

8、ITC-dextran的量有明顯的差異,p＜0.05,即經(jīng)VEGF121處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞,滲透到細(xì)胞層外的FITC-dextran顯著多于VEGF165和空白對照組。說明VEGF121對細(xì)胞通透性影響較VEGF165顯著。
　　 1.2在不同刺激時相之間通透性物質(zhì)有明顯的差異,p＜0.05,即隨著刺激時間的增加,滲透到細(xì)胞層外的通透性物質(zhì)(FITC-dextran)也明顯增加。
　　 1.3刺激時間和不同刺激物之間存在

9、交互作用,p＜0.05。
　　 2、經(jīng)VEGF165或VEGF121刺激人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,培養(yǎng)基中NO產(chǎn)量的測定
　　 2.1 Griess試劑盒測定培養(yǎng)基中NO含量,應(yīng)用重復(fù)測量的方差分析,在不同刺激物之間NO產(chǎn)量有明顯的差異,p＜0.05,即經(jīng)VEGF121處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞,分泌的NO顯著多于VEGF165和空白對照組。VEGF121對細(xì)胞NO產(chǎn)量的影響較VEGF165顯著。
　　 2.2在不同刺激時相之

10、間分泌的NO的量有明顯的差異,p＜0.05,即隨著刺激時間的增加,分泌的NO也明顯增加。
　　 2.3刺激時間和不同刺激物之間存在交互作用,p＜0.05。
　　 結(jié)論:
　　 VEGF121和VEGF165均能夠引起血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加,刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生NO。但是,VEGF121對通透性的影響遠(yuǎn)高于VEGF165,VEGF121刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞所產(chǎn)生的NO含量高于VEGF165,VEGF121可能是導(dǎo)致血管通透