丁酸鈉抑制缺氧致血管內皮細胞通透性增加及其機制研究.pdf

1、目的：
　　血管內皮通透性的增加是很多疾病的病理基礎。缺氧是臨床常見的病理過程，是多種疾病的重要致病因素。研究表明，缺氧可以改變內皮細胞之間的連接作用，破壞血管內皮的完整性，使細胞收縮，細胞間隙增大，細胞間連接復合物的結構破壞，從而使血管內皮細胞通透性增高，如何保護血管內皮的完整性，抑制缺氧導致的血管內皮細胞通透性增高，仍然缺乏有效的措施。丁酸鈉（Sodium butyrate，NaB）作為一種常見的短鏈脂肪酸，由腸道菌群對纖維性

2、食物的消化間接產生。以往的研究表明，丁酸鈉可通過抑制缺氧及炎癥因子，在動脈粥樣硬化和血管重構的防治中發(fā)揮重要作用。另外，丁酸鈉在維持血管細胞屏障功能方面也起作用，能上調緊密連接蛋白，維持正常的血管內皮通透性。丁酸鈉在血管疾病中的應用前景，已得到廣泛關注。但是，丁酸鈉對缺氧所致的血管內皮細胞通透性增高是否產生影響以及作用機制如何，尚不明確。本課題旨在研究丁酸鈉在缺氧所致人臍靜脈內皮細胞通透性改變中的作用，并對其機制進行初步探討。
　

3、　方法：
　　人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）分為常氧組、缺氧組和缺氧+丁酸鈉組（n=3）。采用三氣培養(yǎng)箱復制缺氧（1％O2）HUVEC模型，常氧組（21%O2） HUVECs于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　1.采用transwell小室分析HUVECs通透性；免疫熒光實驗采用cy5-BSA檢測HUVECs跨細胞通透性改變。
　　2.免疫印跡實驗檢測 p120、β-catenin蛋白表達；免疫熒光實驗觀察p120蛋白表達。

4、
　　3.通過CHX抑制蛋白合成和MG-132抑制蛋白降解，檢測p120蛋白表達。
　　4. Carboxy-PTIO抑制 NO，檢測 p120蛋白表達。轉染siRNA（eNOS），檢測p120蛋白表達。
　　5.免疫印跡實驗檢測 eNOS蛋白表達；一氧化氮檢測試劑盒檢測細胞上清液和細胞蛋白 NO水平；免疫熒光實驗檢測p120和eNOS的定位。
　　結果：
　　1.丁酸鈉對缺氧所致人臍靜脈內皮細胞通透性改變

5、的影響：缺氧12h時，培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞通透性顯著增高，與常氧組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（ P＜0.05）；與單純缺氧組相比，缺氧+丁酸鈉（1mmol/L）組人臍靜脈內皮細胞通透性顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。免疫熒光實驗觀察缺氧組和缺氧+丁酸鈉（1mmol/L）組人臍靜脈內皮細胞cy5-BSA熒光強度與常氧組相比，沒有明顯差異。2.丁酸鈉對缺氧條件下人臍靜脈內皮細胞p120蛋白的影響：缺氧12h條件下，人臍靜脈內皮

6、細胞p120蛋白表達顯著降低，與常氧組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而β-catenin蛋白表達與常氧組相比，差異不明顯（P＞0.05）；與單純缺氧組相比，缺氧+丁酸鈉（1mmol/L）組人臍靜脈內皮細胞 p120蛋白表達增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與單純缺氧組相比，缺氧+丁酸鈉（1mmol/L）組人臍靜脈內皮細胞p120蛋白熒光強度增加。
　　3.缺氧條件下p120蛋白穩(wěn)定性的變化：缺氧12h條件下，缺氧

7、+MG-132（25μmol/L）組人臍靜脈內皮細胞 p120蛋白表達顯著增高，與單純缺氧組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；放線菌酮抑制蛋白合成實驗結果顯示：常氧組人臍靜脈內皮細胞p120蛋白的半衰期為16h，缺氧組人臍靜脈內皮細胞 p120蛋白的半衰期為11h，而缺氧+丁酸鈉（1mmol/L）組人臍靜脈內皮細胞p120蛋白的半衰期為25h。
　　4. NO在缺氧 p120蛋白表達變化中的作用：缺氧+Carboxy-PT

8、IO（0.3mmol/L）組與缺氧組相比，p120蛋白表達水平顯著增高，差異具有計學差異（P＜0.05）。
　　5. eNOS在缺氧p120蛋白表達變化中的作用：缺氧12h條件下，轉染siRNA（eNOS）后檢測，人臍靜脈內皮細胞p120蛋白表達與對照siRNA轉染組相比，明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　6.丁酸鈉對缺氧所致人臍靜脈內皮細胞eNOS蛋白表達以及NO分泌的影響：缺氧12h條件下，缺氧+丁酸鈉

9、組人臍靜脈內皮細胞 eNOS蛋白表達與單純缺氧組相比，差異不明顯（P＞0.05）；常氧組、缺氧組、缺氧+丁酸鈉組，細胞培養(yǎng)上清液及細胞蛋白 NO水平無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　7.丁酸鈉對缺氧所致人臍靜脈內皮細胞eNOS/p120共定位變化的影響：缺氧12h條件下，與單純缺氧組相比，缺氧+丁酸鈉（1mmol/L）組人臍靜脈內皮細胞eNOS/p120熒光重合部位減少。
　　結論：
　　1.缺氧導致人臍靜脈內皮

10、細胞通透性增加，丁酸鈉對所缺氧致人臍靜脈內皮細胞通透性增加具有抑制作用。
　　2.缺氧導致人臍靜脈內皮細胞 p120蛋白表達降低，而丁酸鈉可顯著提高缺氧人臍靜脈內皮細胞p120蛋白表達，提示丁酸鈉對缺氧所致人臍靜脈內皮細胞通透性的保護作用是通過上調人臍靜脈內皮細胞p120蛋白表達來實現(xiàn)的。
　　3.丁酸鈉可提高 p120蛋白穩(wěn)定性，上調缺氧組人臍靜脈內皮細胞p120蛋白表達；
　　4. eNOS蛋白水平降低促進缺氧條件