大黃單體降低血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制.pdf

1、血管內(nèi)皮最基本的功能是對液體、蛋白質(zhì)和細(xì)胞維持有效的選擇性屏障，同時允許高效的氣體彌散和電解質(zhì)、炎性細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　在前期研究工作中我們采用萃取技術(shù)粗提大黃，再利用色譜方法對大黃粗提物進(jìn)行分離，得到了21個單體化合物。在此基礎(chǔ)上，本研究利用Transwell小室建立單層人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC）模型，檢測大黃單體對單層HUVEC的通透性影響;以及對H

2、UVEC增殖的作用和內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘蛋白脫落的影響，挑選出大黃的有效單體。再應(yīng)用實(shí)時定量PCR，Western blot以及免疫熒光方法檢測大黃單體對血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘蛋白:VE-cadherin和緊密連接蛋白:ZO-1，Occludin，Claudin-5的基因和蛋白表達(dá)以及細(xì)胞形態(tài)和蛋白表達(dá)強(qiáng)度的影響。最后通過檢測Akt的磷酸化，Rac1的活化，肌球蛋白輕鏈(Myosin Light Chain，MLC)的磷酸化水平和VE-cadheri

3、n的蛋白表達(dá)強(qiáng)度來闡明大黃單體是否通過PI3K/Akt信號通路對Rac1進(jìn)行調(diào)控，繼而對細(xì)胞粘附連接蛋白及肌球蛋白磷酸化的調(diào)節(jié)作用來保護(hù)血管內(nèi)皮屏障的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　第一部分 大黃單體對單層血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性及增殖的影響
　　目的:檢測大黃單體對單層HUVEC的通透性影響，以及對HUVEC增殖的作用和內(nèi)皮細(xì)胞鈣粘蛋白脫落的影響，挑選出大黃的有效單體并闡釋其可能的作用機(jī)理。
　　方法:采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，用Tran

4、swell小室建立單層HUVEC模型，隨機(jī)分為正常對照組，MMP9組，21種大黃單體組，地塞米松組。其中大黃單體組再隨分為1、10、50μmol/L三個亞組。MMP9組，大黃單體組，地塞米松組首先按照lmg/L終濃度在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入MMP9刺激。大黃單體組同時給予大黃單體干預(yù)，21種大黃單體的終濃度分別為1、10、50μmol/L;地塞米松組同時給予10μmol/L的地塞米松干預(yù);正常對照組按照MMP9組的加藥體積，加入等量PBS作為

5、陰性對照。各組加藥完畢，于37℃、5％CO2細(xì)胞孵育箱繼續(xù)培養(yǎng)24小時。用熒光光譜儀測量通過單層HUVEC異硫氰酸熒光素標(biāo)記的葡聚糖(fluorescence ofendocytosedfluorescein isothiocyanate(FITC)-dextran，F(xiàn)D40)的熒光強(qiáng)度反應(yīng)前者通透性大小;HUVEC的增殖和細(xì)胞培養(yǎng)上清液鈣粘蛋白的濃度分別用MTT和elisa方法檢測。
　　結(jié)果:(1)與正常對照組比較，MMP9顯

6、著增加了單層HUVEC的通透性(P＜0.05);而地塞米松和1μmol/L的大黃單體:大黃酸、3，8-二羥-1-甲基蒽醌-2-羧基酸、1-O-咖啡?；?2-（4-羥基-O-肉桂酰）-β-D-葡萄糖、胡蘿卜苷亞油酸酯和大黃素及其混合物都顯著改善了MMP9損傷的單層血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性（P＜0.05）。(2)1μmol/L作用濃度的上述5種單體混合后促進(jìn)了HUVEC的增殖，增殖率為6.6％;而濃度為10、50μmol/L的混合單體抑制了HUV

7、EC的增殖，抑制率分別為7.9％和13％。(3) MMP9刺激后Transwell小室上、下層細(xì)胞培養(yǎng)液VE-cadherin蛋白濃度均顯著升高，而用5種單體及其混合物（1μmol/L）或者DEX（10μmol/L）與MMP9共同干預(yù)后VE-cadherin蛋白濃度明顯降低。
　　結(jié)論:大黃單體:大黃酸、3，8-二羥-1-甲基蒽醌-2-羧基酸、1-O-咖啡?；?2-(4-羥基-O-肉桂酰)-β-D-葡萄糖、胡蘿卜苷亞油酸酯、大黃素

8、通過促進(jìn)HUVEC的增殖和減少胞外VE-cadherin的脫落改善了MMP9損傷的單層HUVEC的通透性。
　　第二部分 大黃單體對MMP9損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞連接蛋白的保護(hù)作用
　　目的:觀察大黃單體對MMP9損傷的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)鈣粘蛋白:VE-cadherin，緊密連接蛋白:ZO-1，Occludin，Claudin-5表達(dá)的影響。
　　方法:采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，建立單層HUVEC模型，隨機(jī)分為

9、4組:Control組、MMP9組、MMP9+大黃單體混合物(monomer mixture，MM)治療組(MMP9+MM組)、MMP9+地塞米松治療組（MMP9+DEX組）;其中MMP9組按1mg/L終濃度加入MMP9刺激;MMP9+MM組在給予1mg/L的MMP9刺激的同時給予大黃5種單體干預(yù):大黃酸，大黃素，3，8-二羥-1-甲基蒽醌-2-羧基酸，1-O-咖啡?；?2-（4-羥基-O-肉桂酰）-β-D-葡萄糖，胡蘿卜苷亞油酸酯，每

10、個單體作用的終濃度都是1 mol/L;MMP9+DEX組:按1mg/L終濃度加入MMP9刺激的同時給予10μmol/L的地塞米松治療。Control組:按照MMP9組的加藥體積，加入等量PBS代替藥物作為陰性對照。繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，分別用實(shí)時定量PCR方法和Western blot方法檢測鈣粘蛋白:VE-cadherin，緊密連接蛋白:ZO-1，Occludin，Claudin-5的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)，用免疫熒光方法檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞的

11、形態(tài)和上述連接蛋白的表達(dá)位置及強(qiáng)度。
　　結(jié)果:(1)給予MMP9刺激以后，HUVEC鈣粘蛋白:VE-cadherin，緊密連接蛋白:ZO-1，Occludin，Claudin-5的基因表達(dá)較Control組均有不同程度下降(P＜0.001)，其中VE-cadherin下降最明顯。用MM或DEX和MMP9共同孵育下，上述4種連接蛋白的基因表達(dá)水平較MMP9組明顯升高（P＜0.001）。同時MMP9+MM組明顯高于MMP+DEX組(

12、P＜0.001)。(2) MMP9刺激導(dǎo)致鈣粘蛋白:VE-cadherin，緊密連接蛋白:ZO-1，Occludin，Claudin-5的蛋白表達(dá)明顯下降，與control組，MMP9+MM組和MMP9+DEX組比較有顯著差異(P＜0.001)。MMP9刺激的同時再用MM干預(yù)上述4種連接蛋白的蛋白表達(dá)水平比用DEX干預(yù)明顯升高。(3)正常組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、胞膜完整，綠色熒光標(biāo)記的連接蛋白顆粒連續(xù)、結(jié)構(gòu)清晰;MMP9刺激后連接蛋白的熒光顆粒

13、顯著減少，斷裂，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)模糊不清;而給予MMP刺激的同時用大黃單體或地塞米松干預(yù)后上述情況得到改善。
　　結(jié)論:大黃酸、3，8-二羥-1-甲基蒽醌-2-羧基酸、1-O-咖啡?；?2-（4-羥基-O-肉桂酰）-β-D-葡萄糖、胡蘿卜苷亞油酸酯和大黃素五種單體能夠升高內(nèi)皮細(xì)胞的粘附連接蛋白和緊密連接蛋白的基因和蛋白表達(dá)，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)和細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)。
　　第三部分 大黃單體混合物改善血管內(nèi)皮通透性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制

14、　　目的:通過檢測大黃單體對PI3K/Akt-Rac1信號通路的影響，及肌球蛋白(Myosin light chain，MLC)磷酸化(p-MLC)的調(diào)節(jié)作用來闡釋其保護(hù)血管內(nèi)皮屏障的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　方法:建立單層臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞模型，隨機(jī)分為Control組，MMP9組，大黃單體混合物(monomer mixture，MM)組，地塞米松(dexamethasone，DEX)組，PI3K抑制劑wortmannin組，Rac1

15、抑制劑組NSC23766(NSC)組共6個組。其中MMP9組、MM組、DEX組、wortmannin組和NSC組細(xì)胞培養(yǎng)液加入1mg/L的MMP9; MM組同時加入lμmol/L的大黃酸、3，8-二羥-1-甲基葸醌-2-羧基酸、1-O-咖啡酰基-2-（4-羥基-O-肉桂酰）-β-D-葡萄糖、胡蘿卜苷亞油酸酯和大黃素共同干預(yù);DEX組同時加入10μmol/L DEX; wortmannin組加入1μmol/L的wortmannin;NSC

16、組加入100μmol/L的NSC23766培養(yǎng)細(xì)胞24h。采用Rac1活性檢測試劑盒檢測Rac1的活性;Western blot方法檢測AKT，p-AKT，VE-cadherin，MLC，p-MLC的表達(dá)。
　　結(jié)果:(1)給予MMP9刺激以后Akt磷酸化(p-Akt)水平較正常對照組明顯增高(P＜0.001)，給予MM、DEX或wortmannin干預(yù)后，能顯著降低p-Akt（P＜0.01）。但較正常對照組仍有一定程度的增高（P

17、＜0.01）。(2) MMP9組較正常組明顯促進(jìn)了Rac1的活性(P＜0.001);應(yīng)用MM、DEX或NSC干預(yù)均能降低Rac1的活性(P＜0.01)。同時VE-cadherin的蛋白表達(dá)量增加，與MMP9組比較(P＜0.05)。(3)MMP9刺激后MLC磷酸化水平較正常對照組明顯增高（P＜0.001），給予MM或DEX干預(yù)顯著降低p-MLC(P＜0.01)。但較正常對照組仍有一定程度的增高(P＜0.01)。
　　結(jié)論:大黃酸、3