血管內(nèi)皮細(xì)胞核漿鈣信號(hào)調(diào)控機(jī)制.pdf

1、Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)最為重要的第二信使之一,其濃度的變化可以引起一系列復(fù)雜細(xì)胞反應(yīng),對(duì)于細(xì)胞粘附、移動(dòng)、擴(kuò)增及基因表達(dá)等功能具有重要作用。鈣信號(hào)對(duì)于人體多種生理功能廣泛調(diào)節(jié)作用自發(fā)現(xiàn)以來(lái)已得到國(guó)內(nèi)外研究人員極大關(guān)注。隨著研究的深入,細(xì)胞內(nèi)各個(gè)獨(dú)立細(xì)胞器如細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體及溶酶體等的鈣信號(hào)變化及相關(guān)調(diào)控機(jī)制已成為該領(lǐng)域近年來(lái)的研究熱點(diǎn);自1995年Gerasimenko等人發(fā)現(xiàn)核鈣信號(hào)以來(lái),關(guān)于核鈣信號(hào)方面的調(diào)控研究一直存在爭(zhēng)議,特別

2、是核鈣信號(hào)是否具有一套不依賴于胞漿鈣信號(hào)的獨(dú)立調(diào)控體系這一問(wèn)題,一直未得到闡明。
　　細(xì)胞核由核被膜及核孔復(fù)合物將其與細(xì)胞質(zhì)分離形成一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的結(jié)構(gòu);通過(guò)核被膜鈣泵、ryanodine受體、IP3受體以及核孔復(fù)合物,細(xì)胞核可以發(fā)揮自主調(diào)節(jié)鈣信號(hào)能力,鈣離子通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸以及擴(kuò)散進(jìn)入或離開細(xì)胞核。核漿鈣信號(hào)目前已被證實(shí)在細(xì)胞增殖、基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要作用。Rodrigues、Pusl等人研究證實(shí)核漿鈣信號(hào)被抑制后,肝癌細(xì)

3、胞或肝細(xì)胞系增殖被顯著抑制,這可能與E1k1轉(zhuǎn)錄因子激活受阻有關(guān)。核鈣信號(hào)也可以通過(guò)核因子NFAT影響基因轉(zhuǎn)錄,從而對(duì)后續(xù)一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生作用;同時(shí)CREB, DREAM等介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄激活亦依賴于核漿鈣離子濃度升高。盡管人們對(duì)于核鈣信號(hào)的研究越來(lái)越深入,但是對(duì)于是否存在不依賴于胞漿鈣信號(hào)核漿鈣信號(hào)現(xiàn)象以及相關(guān)調(diào)控機(jī)制仍然存在爭(zhēng)議。目前研究人員發(fā)現(xiàn)可能參與到核漿鈣信號(hào)調(diào)控機(jī)制的有IP3、ryanodine及NAADP受體,核漿網(wǎng)及

4、鈣調(diào)蛋白等,其中IP3、ryanodine及NAADP受體均被證明參與到核內(nèi)鈣庫(kù)排空過(guò)程;核漿網(wǎng)與胞漿緊密連接,胞漿信號(hào)可通過(guò)其進(jìn)入核內(nèi),且核漿網(wǎng)上存在有IP3及ryanodine受體,亦會(huì)對(duì)核漿鈣離子濃度變化產(chǎn)生影響;而鈣調(diào)蛋白與鈣離子綁定是大多數(shù)鈣離子介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的必須步驟,且已發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)蛋白核轉(zhuǎn)移現(xiàn)象,說(shuō)明其可能參與到核漿鈣信號(hào)調(diào)控過(guò)程中。
　　本次研究通過(guò)TG刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后,再給予不同外鈣濃度平衡鹽溶液,觀察人臍靜脈

5、內(nèi)皮細(xì)胞隨外鈣濃度降低,胞漿與核漿鈣信號(hào)相對(duì)變化情況。研究發(fā)現(xiàn)胞漿鈣信號(hào)隨外鈣濃度降低而降低,而核漿鈣信號(hào)在達(dá)到一定閾值后獨(dú)立于胞漿鈣信號(hào)變化,不再降低;在較高外鈣濃度條件下,其獨(dú)立變化被胞漿鈣信號(hào)變化所掩蓋。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果是獨(dú)立于胞漿鈣信號(hào)調(diào)控的核漿鈣信號(hào)調(diào)控存在的有力證據(jù)之一;研究進(jìn)一步確定,在0.1mM外鈣濃度條件下,可以進(jìn)行獨(dú)立于胞漿鈣信號(hào)的核漿鈣信號(hào)研究;在這一研究策略基礎(chǔ)上,我們對(duì)于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞這一獨(dú)立核鈣信號(hào)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行

6、了初步探索。已有研究表明,IP3受體及ryanodine受體可能參與到核漿鈣信號(hào)調(diào)控過(guò)程中,故本次研究中使用IP3受體抑制劑heparin、XeC及ryanodine受體抑制劑ryanodine分別作用于細(xì)胞,觀察處理后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞核漿與胞漿鈣信號(hào)相對(duì)變化。研究結(jié)果顯示ryanodine受體參與獨(dú)立于胞漿鈣信號(hào)調(diào)控的核鈣信號(hào)調(diào)控機(jī)制,而IP3受體并未參與。已有研究對(duì)于獨(dú)立于胞漿鈣信號(hào)調(diào)控的核漿鈣信號(hào)調(diào)控是否存在,以及核鈣信號(hào)相關(guān)調(diào)控

7、機(jī)制爭(zhēng)議較多,本次研究結(jié)果為證實(shí)獨(dú)立胞漿鈣信號(hào)存在,進(jìn)一步深入研究核鈣信號(hào)調(diào)控相關(guān)作用機(jī)制提供了理論依據(jù)及新的線索。
　　目的:本次研究旨在探尋胞漿鈣信號(hào)非依賴性核漿鈣信號(hào)調(diào)控現(xiàn)象;確定獨(dú)立研究核漿鈣信號(hào)實(shí)驗(yàn)策略;探討胞漿鈣信號(hào)非依賴性核漿鈣信號(hào)相關(guān)調(diào)控機(jī)制,并為更深入的核漿鈣信號(hào)調(diào)控研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.采用0.25％胰蛋白酶消化法原代及傳代培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。
　　2.胞漿鈣信號(hào)非依賴性核漿鈣

8、信號(hào)現(xiàn)象探索:首先TG(thapsigargin)刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,再給予不同細(xì)胞外鈣濃度(0.03mM/0.1mM/0.3mM/1mM/2mM) HBS溶液,通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察隨細(xì)胞外鈣濃度降低,核漿鈣信號(hào)與胞漿鈣信號(hào)相對(duì)變化情況,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較,觀察是否存在胞漿鈣信號(hào)非依賴性核漿鈣信號(hào)現(xiàn)象存在。
　　3.胞漿鈣信號(hào)非依賴性核漿鈣信號(hào)調(diào)控機(jī)制探索:在上步實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,選用0.1mM細(xì)胞外鈣濃度作為胞漿非依賴性核漿鈣信號(hào)調(diào)控

9、機(jī)制研究作用細(xì)胞外鈣濃度,分別給予heparin、XeC及ryanodine處理,與給予同樣處理2mM細(xì)胞外鈣濃度作用下細(xì)胞胞漿鈣信號(hào)與核漿鈣信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較,以證實(shí)IP3受體以及ryanodine受體是否參與到胞漿鈣信號(hào)非依賴性核漿鈣信號(hào)調(diào)控機(jī)制中。
　　結(jié)果:
　　1.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞TG處理后,胞漿鈣信號(hào)隨細(xì)胞外鈣濃度下降而下降,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,n=214);核漿鈣信號(hào)在給予2mM,1mM及0

10、.3mM細(xì)胞外鈣濃度條件下隨細(xì)胞外鈣濃度下降而下降,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,n=135);但在給予給予更低濃度(0.1mM Ca2+,0.03mM Ca2+)細(xì)胞外鈣條件下,核漿鈣信號(hào)與0.3mM細(xì)胞外鈣條件下比較無(wú)明顯變化,組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=NS,n=123)。
　　2.heparin處理組:0.1mM細(xì)胞外鈣條件下,給予TG處理后,heparin處理組細(xì)胞核漿鈣信號(hào)、胞漿鈣信號(hào)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意

11、義(P=NS,n=84);2mM細(xì)胞外鈣條件下,給予TG處理后,heparin處理組細(xì)胞核漿鈣信號(hào)、胞漿鈣信號(hào)與對(duì)照組比較差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=NS,n=84)。
　　3.XeC處理組:0.1mM細(xì)胞外鈣條件下,給予TG處理后,XeC處理組細(xì)胞核漿鈣信號(hào)、胞漿鈣信號(hào)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=NS,n=80);2mM細(xì)胞外鈣條件下,給予TG處理后,XeC處理組細(xì)胞核漿鈣信號(hào)、胞漿鈣信號(hào)與對(duì)照組比較差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=N

12、S,n=80)。
　　4.ryanodine處理組:0.1mM細(xì)胞外鈣條件下,給予TG處理后,ryanodine處理組細(xì)胞核漿鈣信號(hào)與對(duì)照組比較明顯被抑制,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,n=86),胞漿鈣信號(hào)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=NS,n=86);2mM細(xì)胞外鈣條件下,給予TG處理后,ryanodine處理組細(xì)胞核漿鈣信號(hào)與對(duì)照組比較明顯被抑制,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,n=86),胞漿鈣信號(hào)與

13、對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=NS,n=86)。
　　結(jié)論:
　　1.在給予較高濃度外鈣條件下,血管內(nèi)皮細(xì)胞核漿鈣信號(hào)獨(dú)立變化被胞漿鈣信號(hào)變化所掩蓋;而較低細(xì)胞外鈣濃度刺激時(shí),核漿鈣信號(hào)變化不依賴于胞漿鈣信號(hào);存在胞漿鈣信號(hào)非依賴性核漿鈣信號(hào)現(xiàn)象,其調(diào)控獨(dú)立于胞漿鈣信號(hào),具有自己獨(dú)特的調(diào)控機(jī)制;同時(shí)確立研究獨(dú)立于胞漿鈣信號(hào)核漿鈣信號(hào)調(diào)控機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究方法,即TG刺激后,在0.1mM細(xì)胞外鈣濃度條件下,觀察對(duì)照組與受體抑制劑處

14、理組細(xì)胞核漿與胞漿鈣信號(hào)相對(duì)變化情況,確定胞漿鈣信號(hào)非依賴性核漿鈣信號(hào)具體調(diào)控機(jī)制。
　　2.IP3受體被特異性抑制劑抑制后,TG刺激后給予0.1mM及2mM細(xì)胞外鈣條件下,核漿鈣信號(hào)、胞漿鈣信號(hào)與正常細(xì)胞比較均未受到明顯抑制;證明其未參與到胞漿鈣信號(hào)非依賴性核漿鈣信號(hào)調(diào)控機(jī)制中。
　　3.ryanodine受體被特異性抑制劑抑制后,TG刺激后給予0.1mM細(xì)胞外鈣條件下,核漿鈣信號(hào)與正常細(xì)胞比較明顯被抑制,而胞漿鈣信號(hào)比較