CREG對人動脈內(nèi)皮細胞單層通透性的影響及調(diào)控機制的研究.pdf

1、目的:血管生成方法的探索給治療缺血性心臟病帶來了突破性進展,其目的是通過增加有功能冠狀動脈分支或側(cè)枝循環(huán),達到恢復(fù)缺血心肌血供,改善患者癥狀和預(yù)后的目的。而血管通透性增加是血管生成序列事件的一個環(huán)節(jié)。細胞因子和炎癥介質(zhì)大多數(shù)是通過改變內(nèi)皮細胞(ECs)肌動蛋白骨架,使ECs收縮或回縮,細胞間隙增大,導(dǎo)致細胞單層通透性增高;并可破壞血管ECs間粘附連接蛋白VE-cadherin,引起ECs間隙形成,通透性增加。E1A激活基因阻遏子(CRE

2、G)是新近發(fā)現(xiàn)的一個細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,其在分化成熟的組織、細胞中廣泛表達,而在去分化的組織中低表達。已有研究表明CREG可促進體外培養(yǎng)的人血管平滑肌細胞(VSMCs)分化成熟,抑制其增殖、凋亡,并可促進動脈ECs的增殖與遷移,提示CREG對血管的穩(wěn)態(tài)起著調(diào)控作用,然而CREG對ECs通透性有何影響尚未見報道。本研究以體外培養(yǎng)的人動脈ECs為研究對象,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)CREG在動脈ECs中過表達及表達下調(diào),觀察CREG表達對動脈EC

3、s單層通透性的影響,并探討CREG調(diào)節(jié)血管ECs通透性的機制。
　　 方法:
　　 1.采用Transwell chamber彌散模型,分別檢測CREG過表達(Overexpression,EO)、表達下調(diào)(Suppression,ES)及正常表達(Normal,EN)的人動脈ECs單層通透性的改變。用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測ECs的VEGF分泌并添加VEGF中和抗體處理,觀察對ECs單層通透性的影響。

4、　　 2.利用異硫氰酸鹽標記的鬼筆堿對EO、EN及ES的肌動蛋白骨架F-actin進行染色,在熒光倒置顯微鏡下觀察ECs肌動蛋白骨架F-actin分布變化及加入VEGF中和抗體后對ECs肌動蛋白骨架F-actin重排的影響。
　　 3.應(yīng)用免疫熒光染色的方法,在熒光倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)融合至單層的EO、EN及ES三組ECs粘附連接蛋白VE-cadherin及緊密連接蛋白claudin-5表達的變化以及加入VEGF中和抗體處理后

5、對ECs粘附連接蛋白VE-cadherin及緊密連接蛋白claudin-5表達變化的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.CREG過表達的EO組細胞單層通透性明顯增加(0.0490±0.0016),與EN對照組(0.0376±0.0061)比較差異顯著(p＜0.05)。同時,CREG表達下調(diào)的ES組單層通透性下降(0.0324±0.0114),與EN對照組O.0376±0.0061)比較差異顯著(p＜0.05)。ELISA結(jié)果

6、顯示,與EN組(577.20±10.43)pg/ml相比,CREG過表達的EO組細胞中VEGF分泌量最高(1392.00±5.83)pg/ml,而CREG表達下調(diào)的ES組細胞中VEGF分泌量最低(391.40±4.04)pg/ml,三者(EO組、EN組、ES組)均有顯著差異(p＜0.05)。加入VEGF中和抗體后,EO組細胞單層通透性下降(0.0388±0.0013),與處理前(0.049±0.0017)比較差異顯著(p＜0.05)。<

7、br>　　 2.熒光倒置顯微鏡下,可見正常對照EN組ECs連接緊密,F-actin主要分布于細胞膜,呈“花環(huán)”樣,少量呈細絲狀無序分布于胞漿,核周偶有應(yīng)力纖維形成。EO組ECs呈明顯向心性回縮,細胞間隙增大,細胞內(nèi)F-actin的構(gòu)像和分布發(fā)生變化,邊聚現(xiàn)象消失,細胞中心的F-actin明顯增多,出現(xiàn)大量的應(yīng)力纖維,并呈非極性分布和呈典型的竹排樣結(jié)構(gòu)。ES組的F-actin主要分布在細胞周邊,中心也有少量分布。加入VEGF中和抗體后,

8、EO組肌動蛋白F-actin向細胞膜處轉(zhuǎn)移,以細胞中心為主的分布轉(zhuǎn)變?yōu)橐约毎苓叿植紴橹?邊聚現(xiàn)象有所恢復(fù),相鄰細胞間F-actin相互連接,細胞內(nèi)應(yīng)力纖維形成有所減少。ES組與EN組則變化不明顯。
　　 3.熒光倒置顯微鏡下,正常對照EN組ECs粘附連接蛋白VE-cadherin在血管ECs周邊呈正常鏈狀染色,連接緊密。EO組ECs粘附連接蛋白VE-adherin在血管ECs周邊的正常鏈狀染色減少或脫失,細胞間縫隙增寬;緊密連

9、接蛋白claudin-5表達量較EN及ES組明顯減少。加入VEGF中和抗體后,EO組ECs粘附連接蛋白VE-cadherin在血管ECs周邊的正常鏈狀染色較前增多,連接緊密:緊密連接蛋白claudin-5表達較前增多。ES組與EN組則變化不明顯。
　　 結(jié)論:CREG過表達可能通過VEGF介導(dǎo)的信號途徑引起體外培養(yǎng)的人動脈ECs骨架蛋白F-actin重構(gòu)及粘附連接蛋白VE-cadherin、緊密連接蛋白claudin-5表達減少