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文檔簡介
1、目前,越來越多的研究證實腎小球足細胞分泌的一些分子能影響腎小球內皮細胞的結構和功能,導致。腎小球內皮細胞濾過功能的改變而參與蛋白尿的發(fā)生和發(fā)展,如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和血管生成素1(angiopoietin1,Ang1)。本課題組曾應用基因芯片技術發(fā)現微小病變腎病綜合征患兒的血管生成素樣蛋白3(angiopoietin-like protein3,Angptl
2、3)mRNA的表達水平顯著高于正常兒童,及應用激光微切割技術分離腎組織發(fā)現在阿霉素大鼠腎病模型的腎小球內Angptl3 mRNA和蛋白的表達隨著蛋白尿的加重而表達增高,并運用Western免疫印跡和實時熒光定量PCR技術發(fā)現體外培養(yǎng)的足細胞表達Angptl3,進一步還發(fā)現在微小病變和膜性腎病腎小球內Angptl3顯著高于正常對照、薄基底膜腎病及局灶節(jié)段性腎小球硬化。以上實驗結果顯示Angptl3在腎小球內由足細胞分泌,并可能參與了蛋白尿
3、的發(fā)生和發(fā)展。
血管生成素樣蛋白是與血管生成素結構相似的糖蛋白,其含有N端的卷曲螺旋結構和C段的纖維蛋白原同源區(qū)域。研究發(fā)現Angptl3能與臍靜脈內皮細胞整合素αvβ3纖維蛋白原同源區(qū)域結合,而其它研究已發(fā)現整合素αvβ3也是腎小球內皮細胞(glomerular endothelial cells,GEnCs)表達的整合素異構體之一。因此,我們推測在腎小球由足細胞分泌Angptl3可能通過與腎小球內皮細胞表面整合素αvβ
4、3結合調節(jié)腎小球內皮細胞的通透性參與了蛋白尿的發(fā)生和發(fā)展。為此我們進行了以下三部分的研究,以探討Angptl3是否能調節(jié)腎小球內皮細胞的通透性并研究其作用的可能機制。
第一部分腎小球內皮細胞培養(yǎng)和單層膜的建立
目的:觀察腎小球內皮細胞在微孔細胞培養(yǎng)嵌套的濾膜上是否能形成生成致密連接的單層膜。
方法:以3-8代的GEnCs密度為1×105/cm2接種于微孔細胞嵌套濾膜上。對濾膜腎小球內皮細胞行考馬
5、斯亮蘭染色和定期測定濾膜腎小球內皮細胞電阻以確定GEnCs是否形成致密連接的單層膜。
結果:考馬斯亮蘭染色見GEnCs單層膜呈現為藍色的片狀,細胞間無間隙,表明GEnCs匯合成致密的單層。形成致密融合狀態(tài)的腎小球內皮細胞單層膜電阻為(30.45±1.52)Ω/cm2。
結論:在微孔細胞嵌套濾膜上生長的腎小球內皮細胞能形成致密的單層膜。
第二部分血管生成素樣蛋白3調節(jié)腎小球內皮細胞通透性
6、 目的:探討血管生成素樣蛋白3對腎小球內皮細胞通透性的影響。方法:腎小球內皮細胞接種于微孔細胞培養(yǎng)嵌套的濾膜上,待細胞形成致密的單層膜后,分別給予不同濃度的Angptl3(0.02μg/ml、0.1μg/ml、0.5μg/ml、2.51μg/ml)作用1h;用濃度為0.5μg/ml Angptl3分別作用于GEnCs1h、2h、3h。采用Millicell-ERS和兩室彌散系統分別檢測跨GEnCs單層膜電阻(TEER)和跨GEnCs
7、異硫氰酸熒光素標記的白蛋白(FITC-BSA)濾過率。
結果:Angptl3可顯著增加GEnCs的通透性,且呈劑量效應關系和時間效應關系。(1)Angptl3濃度達到0.1μg/ml始明顯降低TEER和增加GEnCs對FITC-BSA的濾過率,分別為TEER降低33.2%(20.32Ω/cm2±4.52Ω/cm2 vs30.42Ω/cm2±1.45Ω/cm2)、FITC-BSA濾過率增加42.5%(0.17±0.045 v
8、s0.12±0.019)(與對照組比較,P<0.01),Angptl3濃度達到0.5μg/ml時,其對GEnCs的作用達到飽和;(2)0.5μg/ml Angptl3作用GEnCs1h、2h、3h可使TEER分別降低46.9%(16.19Ω/cm2±3.26Ω/cm2 vs30.61Ω/cm2±5.65Ω/cm2)、19.5%(24.81Ω/cm2±2.53Ω/cm2 vs30.82±5.72Ω/cm2)、16.0%(25.76Ω/cm
9、2±2.12Ω./cm2 vs30.6±5.76Ω/cm2),可使FITC-BSA濾過率分別增加63.6%(0.20±0.032 vs0.12±0.027)、59.7%(0.1±0.056 vs0.16±0.045)、50.9%(0.30±0.089 vs0.2±0.072)(與對照組比較,P<0.01)。
結論:血管生成素樣蛋白3能導致腎小球內皮細胞通透性的增加,引起跨腎小球內皮細胞單層膜電阻下降和對FITC-BSA濾過
10、率增加。
第三部分血管生成素樣蛋白3調節(jié)腎小球內皮細胞通透性機制的研究
目的:探討血管生成素樣蛋白3調節(jié)腎小球內皮細胞的信號通路。
方法:(1)腎小球內皮細胞無血清饑餓1小時,再加入血管生成素樣蛋白3(0.5μg/ml)或PBS作用1、2、3、4、5、6小時,Western blot檢測不同處理時間點磷酸化Akt、總Akt、磷酸化FAK、總FAK、磷酸化ERK、總ERK的表達水平;(2)PI3K
11、/Akt信號通路PI3K特異性抑制劑-LY294002(1μM)或MAPK信號通路的MEK特異性抑制劑-PD89095(1μM)預處理腎小球內皮細胞1小時,再加入血管生成素樣蛋白3(0.5μg/ml)共作用1小時,測定腎小球內皮細胞單層膜電阻和對FITC-BSA的濾過率;(3)整合素αvβ3單克隆抑制劑-LM609(1μM)預處理腎小球內皮細胞1小時,再加入血管生成素樣蛋白3(0.5μg/ml)共孵育1、3、5小時,Western bl
12、ot檢測磷酸化Akt和總Akt的表達水平;(4)LM609(1μM)預處理腎小球內皮細胞1小時,再加入血管生成素樣蛋白3(0.5μg/ml)共孵育1小時,測定腎小球內皮細胞單層膜電阻和對FITC-BSA的濾過率。
結果:(1)Angptl3處理后腎小球內皮細胞磷酸化Akt和磷酸化FAK的表達水平顯著增高(與對照組相比,P<0.01),磷酸化的ERK無明顯變化(與對照組比較,P>0.051;(2)PI3K信號通路抑制劑LY2
13、94002預處理腎小球內皮細胞1小時能顯著抑制Angptl3誘導的腎小球內皮細胞通透性的增高,能使Angptl3引起的跨腎小球內皮細胞的TEER下降減少約71%和對FITC-BSA濾過率的增加下降約76%(與血管生成素樣蛋白3處理組比較,P<0.01),而MAPK信號通路抑制劑PD98059對Angptl3誘導的腎小球內皮細胞的TEER的下降和對FITC-BSA濾過率的增加沒有顯著抑制作用(與血管生成素樣蛋白3處理組比較,P>0.05)
14、;(3)LM609(1μM)預處理腎小球內皮細胞1小時,能顯著抑制Angptl3誘導的磷酸化Akt的增高(與血管生成素樣蛋白3處理組比較,P<0.01);(4)LM609(1μM)預處理腎小球內皮細胞1小時,能顯著抑制Angptl3誘導的腎小球內皮細胞通透性的增高,能使Angptl3引起的跨GEnCs的TEER下降減少約74%和對FITC-BSA濾過率增加下降約77%(與血管生成素樣蛋白3處理組比較,P<0.01)。
結論
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