Caveolin-1對脂多糖和內(nèi)脂素增加肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的作用.pdf

1、目的：肺微血管通透性增加及隨之而來的肺間質(zhì)和肺泡水腫是ARDS的重要病理特征。血管內(nèi)皮通透性包括跨細(xì)胞通透性和細(xì)胞旁通透性兩個方面。生理狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞間連接會限制血液中生物大分子如白蛋白的通過，血管內(nèi)皮對白蛋白的基礎(chǔ)通透性主要取決于caveolae介導(dǎo)的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。也有研究表明，caveolae介導(dǎo)的白蛋白跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)不僅在生理狀態(tài)下對維持正常組織膠體滲透壓起決定性作用，而且也參與炎癥刺激（如活化的中性粒細(xì)胞等）導(dǎo)致的肺微血管通透性增加

2、，此過程中可觀察到Cav-1磷酸化和caveolae增加。嚴(yán)重感染時，細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，目前已知的機(jī)制有LPS激活部分細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，破壞細(xì)胞間連接從而增加細(xì)胞旁通透性。關(guān)于在 LPS致肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加過程中，跨細(xì)胞通透性如何變化及期間小窩蛋白-1（caveolin-1，Cav-1）和caveolae所起作用尚未見報道。
　　Visfatin又稱內(nèi)脂

3、素，是一種主要來源于內(nèi)臟脂肪的新型脂肪細(xì)胞因子，具有多種生物學(xué)功能，除降低血糖、誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化等效應(yīng)外，還可促進(jìn)細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，進(jìn)而參與體內(nèi)炎癥反應(yīng)，并引起血管內(nèi)皮功能紊亂。另有報道visfatin可誘導(dǎo)細(xì)胞膜上―脂筏‖聚集，通過促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)等使單層內(nèi)皮細(xì)胞的通透性增加，而 caveolae正是―脂筏‖中最主要的一種類型。臨床資料也顯示visfatin可能參與 ARDS的發(fā)生發(fā)展，但其對肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（pulmonary mi

4、crovascular endothelial cells，PMVECs）的直接損傷效應(yīng)及作用機(jī)制是否與Cav-1有關(guān)，目前尚未見報道。
　　本課題擬檢測LPS對大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（rat pulmonary microvascular endothelial cells，RPMVECs）白蛋白內(nèi)吞和跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，探討其中Cav-1和caveolae所起的作用；再就visfatin對RPMVECs損傷與否及相關(guān)可能機(jī)制進(jìn)行初

5、步研究。
　　方法：本研究體外培養(yǎng)RPMVECs并鑒定，經(jīng)胰酶消化傳代，取2-6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；先給予細(xì)胞 LPS刺激，利用A488標(biāo)記白蛋白檢測細(xì)胞白蛋白內(nèi)吞，將RPMVECs接種于Transwell，用伊文思藍(lán)標(biāo)記白蛋白（evans blue bound to BSA，EBA）檢測大分子物質(zhì)跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，電阻抗儀測定跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值（transendothelial electrical resistance，TER）反映細(xì)胞旁

6、通透性，同時Western blot法檢測Cav-1磷酸化及轉(zhuǎn)位，并用激光共聚焦顯微鏡觀察Cav-1表達(dá)定位；然后給予PP2或甲基β環(huán)糊精（methyl-β-cyclodextrin，MβCD）預(yù)處理以抑制Src激酶活性或破壞caveolae結(jié)構(gòu)，相同方法檢測預(yù)處理對LPS所致上述效應(yīng)的影響；另外分別用visfatin、LPS或visfatin＋LPS刺激RPMVECs，Western blot法了解PKC活化及Cav-1、ERM磷酸化

7、程度，檢測EBA透過細(xì)胞單層及TER的變化，并用FITC-鬼筆環(huán)肽經(jīng)熒光顯微鏡觀察細(xì)胞肌動蛋白骨架；再用TER反映PKC抑制劑—BIM對visfatin致細(xì)胞通透性變化的影響。
　　結(jié)果：
　　1.體外成功分離培養(yǎng) RPMVECs，并經(jīng)形態(tài)學(xué)、CD34和FITC-異植物凝集素（FITC-BSI）結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)。
　　2.10μg/ml LPS刺激RPMVECs，Cav-1第14位酪氨酸殘基的磷酸化自刺激后5min開始升高

8、，30min達(dá)高峰，60min時有所下降，但仍高于基礎(chǔ)值，于相同時相點(diǎn)檢測總Cav-1，未見其蛋白含量變化。
　　3.10μg/ml LPS刺激RPMVECs，western blot法測得Cav-1自Triton可溶區(qū)域向Triton不可溶區(qū)域的轉(zhuǎn)位（translocation）自刺激后5min開始增加，15min時達(dá)高峰，之后逐漸下降但仍持續(xù)至60min以后，同時激光共聚焦顯微鏡下可見LPS刺激15min時Cav-1明顯自胞膜

9、向胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)移。
　　4.10μg/ml LPS刺激RPMVECs15min，鏡下見RPMVECs對A488標(biāo)記白蛋白的內(nèi)吞增加，相同時相點(diǎn)EBA經(jīng)Transwell中細(xì)胞單層的通透性開始增加，但此時TER尚未見明顯變化，繼續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)TER自LPS刺激30min才開始降低。
　　5.15μmol/L PP2預(yù)處理RPMVECs可明顯減少LPS誘導(dǎo)的Cav-1磷酸化（P＜0.05），15μmol/L PP2或2.0mmol/L

10、MβCD預(yù)處理均可使LPS誘導(dǎo)的Cav-1轉(zhuǎn)位減少（P＜0.05）。
　　6.15μmol/L PP2或2.0mmol/L MβCD預(yù)處理RPMVECs明顯抑制LPS誘導(dǎo)的A488標(biāo)記白蛋白內(nèi)吞增加，減少LPS刺激15min時EBA的通透性。
　　7.0.5μg/ml visfatin單獨(dú)刺激RPMVECs15min并不能使EBA經(jīng)細(xì)胞單層的通透性增加，但加重此時LPS致白蛋白跨細(xì)胞通透性增加的程度。
　　8.0.5μ

11、g/ml visfatin單獨(dú)刺激RPMVECs，自刺激30min后TER開始下降，至少持續(xù)至180min，同時可觀察到細(xì)胞F-actin骨架排列紊亂，與10μg/ml LPS引起RPMVECs的TER及F-actin骨架變化類似但程度較輕，而visfatin+LPS共同作用的損傷效應(yīng)更加顯著。
　　9.0.5μg/ml visfatin刺激RPMVECs30min時，western blot法顯示細(xì)胞PKC被激活轉(zhuǎn)位，同時Cav

12、-1和ERM磷酸化水平增加。
　　10.1μmol/L BIM預(yù)處理RPMVECs可明顯減輕visfatin引起的單層細(xì)胞TER降低的程度。
　　結(jié)論：
　　1. LPS呈時間依賴性增加RPMVECs上Cav-1的磷酸化，并促使Cav-1表達(dá)轉(zhuǎn)位。
　　2. LPS誘導(dǎo)的Cav-1磷酸化部分受Src激酶調(diào)控，抑制Src激酶或破壞cavelae結(jié)構(gòu)均可抑制Cav-1轉(zhuǎn)位。
　　3. LPS刺激 RPMVECs