脂多糖刺激心臟微血管通透性增高的機制研究.pdf

1、目的:探討脂多糖刺激心臟微血管通透性增高的可能機制。
　　方法:取1月齡SD大鼠心臟，機械分離出左心室中內(nèi)3/4，充分剪碎組織，采用蛋白酶消化法原代培養(yǎng)及純化大鼠心臟微血管內(nèi)皮細胞，采用倒置顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察，采用Ⅷ因子和CD31免疫細胞化學(xué)染色和體外小管形成實驗鑒定，傳代并采用P2～4代。體外單層內(nèi)皮細胞通透性實驗檢測不同濃度不同作用時間脂多糖(LPS)刺激大鼠心臟微血管內(nèi)皮細胞通透性的變化，蛋白免疫印跡法和免疫熒光細胞化學(xué)技術(shù)檢

2、測不同濃度不同作用時間LPS刺激大鼠心臟微血管內(nèi)皮細胞中整合素β3表達的部位和變化，選取最佳LPS作用濃度和作用時間。采用整合素β3過表達腺病毒轉(zhuǎn)染和特異性封閉抗體抑制整合素β3活性，體外單層內(nèi)皮細胞通透性實驗檢測整合素β3過表達和封閉后大鼠心臟微血管內(nèi)皮細胞通透性的變化。羅丹明鬼筆環(huán)肽染色檢測LPS刺激和整合素β3過表達腺病毒轉(zhuǎn)染后細胞骨架F-actin的變化。采用特異性抑制劑抑制Src/Rac1活化，體外單層內(nèi)皮細胞通透性實驗檢測各

3、處理組通透性的變化。采用蛋白免疫印跡法檢測LPS刺激和整合素β3過表達腺病毒轉(zhuǎn)染后Src及Rac1活性的變化。
　　結(jié)果:
　　(1)大鼠心臟微血管內(nèi)皮細胞原代培養(yǎng)及鑒定。原代培養(yǎng)時接種2h大部分已貼壁完成，24 h細胞充分伸展，呈短梭型、三角形或多角形，細胞散在分布或呈集落狀生長。細胞長至融合后呈典型的“鋪路石”或“鵝卵石”征。原代周期3～4d，傳代周期2～3 d。Ⅷ因子和CD31免疫細胞化學(xué)染色陽性率95％以上，1％ F

4、BS條件下培養(yǎng)16h可見體外小管形成。
　　(2) LPS刺激后，心臟微血管的通透性增高。LPS刺激6h單層大鼠心臟微血管內(nèi)皮細胞通透性變化呈濃度依賴性，在20 ng/mL時開始升高，50 ng/mL達高峰，100 ng/mL起下降至平臺期。LPS(50 ng/mL)刺激單層大鼠心臟微血管內(nèi)皮細胞通透性變化呈時間依賴性，表現(xiàn)為逐漸增高，6h起有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(3)整合素β3表達于大鼠心臟微血管內(nèi)皮細胞表面，不同濃度LPS

5、刺激6h后，整合素β3表達先增高后降低，10 ng/mL組和20 ng/mL組表達顯著增加，50 ng/mL組開始表達顯著下調(diào)，但100 ng/mL組、1μg/mL組與50ng/mL組表達量相仿，并無統(tǒng)計學(xué)差異。LPS(50 ng/mL)刺激不同時間后，6h起整合素β3表達逐漸降低。整合素β3過表達腺病毒轉(zhuǎn)染24 h后，整合素β3表達較正常對照組和LPS組顯著增加。
　　(4)整合素β3改善LPS刺激后心臟微血管的高通透性。整合素

6、β3封閉組LPS刺激后通透性較LPS組顯著升高，整合素β3過表達組LPS刺激后通透性較LPS組通透性顯著降低。
　　(5)整合素β3可能通過減少細胞骨架蛋白重構(gòu)增強血管屏障功能。正常情況下細胞骨架蛋白(F-actin)主要分布于細胞周邊，LPS刺激后F-actin重構(gòu)，雜亂無序，形成應(yīng)力纖維(Stress Fibers)。整合素β3過表達后可有效抑制F-actin重構(gòu)，減少Stress Fibers形成。
　　(6)抑制Sr

7、c/Rac1信號途徑可顯著改善LPS刺激后心臟微血管的高通透性。抑制Src活性后予LPS刺激，其通透性較LPS組顯著下降。同樣，抑制Rac1活性后予LPS刺激，其通透性較LPS組也顯著下降。
　　(7)整合素β3不影響Src/Rac1信號途徑活化。與正常對照組相比，LPS刺激后，Src和Rac1活化顯著增加，整合素β3過表達組LPS刺激后Src與Rac1活化與LPS組相比較均無顯著變化。
　　結(jié)論:本研究探討了LPS刺激心臟

8、微血管通透性增高的可能機制。發(fā)現(xiàn)LPS刺激后整合素β3的表達有顯著變化，而且整合素β3對LPS刺激心臟微血管引起的高通透性有保護作用，整合素β3過表達后能顯著降低LPS誘導(dǎo)的心臟微血管高通透性，而整合素β3特異性封閉抑制活性后LPS誘導(dǎo)的心臟微血管的通透性顯著增高。整合素β3可能通過抑制細胞骨架重構(gòu)增強LPS刺激后心臟微血管屏障功能，但作用機制并不通過影響Src/Rac1信號途徑活化。整合素β3及其潛在的作用機制可能成為膿毒癥心臟微血管