內(nèi)毒素脂多糖對(duì)血迷路屏障通透性的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、分泌性中耳炎是臨床常見(jiàn)疾病之一，目前其發(fā)病原因及機(jī)制尚不十分清楚，被認(rèn)為是多種因素造成的，包括細(xì)菌病毒感染等。脂多糖（Lipopolysaccharide， LPS）作為革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種成分，研究顯示它在分泌性中耳炎發(fā)病過(guò)程中起著重要作用，能夠在中耳腔觸發(fā)一系列炎癥反應(yīng)，包括激活宿主的巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生大量炎性介質(zhì)和生物活性物質(zhì)等。許多研究已經(jīng)證明脂多糖觸發(fā)的中耳炎癥產(chǎn)生大量的炎性因子還可通過(guò)圓窗或者卵圓窗感染耳蝸，引起內(nèi)耳結(jié)構(gòu)

2、和功能炎性改變，破壞內(nèi)耳內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的平衡。血管紋血迷路屏障（the intrastrial fluid–blood barrier）是血迷路屏障（blood-lybrinth barrier，BLB）的主要構(gòu)成，雖然在調(diào)節(jié)血流量方面起著次要作用，但是在對(duì)于維持耳蝸靜息電位，調(diào)控離子轉(zhuǎn)運(yùn)和維持內(nèi)耳內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要作用。脂多糖是如何影響血管紋血迷路屏障的，其具體機(jī)制尚不十分清楚。本次試驗(yàn)中，我們分別通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)和體外離體模型來(lái)研究脂多糖

3、對(duì)血迷路屏障通透性的影響及分子作用機(jī)制。
　　首先我們運(yùn)用聚焦離子/電子雙束顯微電鏡（FIB/SEM）技術(shù),獲取高清血管紋血迷路屏障的超微結(jié)構(gòu)圖，發(fā)現(xiàn)血迷路屏障不僅有基質(zhì)膜和內(nèi)皮細(xì)胞(Endothial cell，EC)組成，還有大量的周細(xì)胞（Pericyte,PC）和血管旁定居的巨噬細(xì)胞樣黑色素細(xì)胞（ perivascular-resident macrophage-like melanocytes， PVM/M）。并運(yùn)用先進(jìn)的

4、VolRoverN軟件進(jìn)行3D重建，重建的三維圖清晰地顯示三種細(xì)胞的位置關(guān)系，有助于我們更好地理解血迷路屏障結(jié)構(gòu)。EC被緊密連接結(jié)合在一起，形成內(nèi)耳阻礙大部分血源性物質(zhì)進(jìn)入內(nèi)耳的第一道屏障，與EC緊密相連的 PC，形成第二道防線，對(duì)血迷路屏障的完整性起著非常重要作用。PVM/M，一種既具有黑色素細(xì)胞又具有巨噬細(xì)胞特性的復(fù)雜細(xì)胞類型，借助細(xì)長(zhǎng)的胞漿偽足與血管壁緊密連接，形成了血-迷路屏障的又一道防線。我們?cè)囵B(yǎng)血管紋EC、PC和PVM/

5、M，并利用其建立3D懸滴球體共培養(yǎng)模型，球體模型形成過(guò)程是細(xì)胞與細(xì)胞之間完全自發(fā)，自然的結(jié)合，不依靠任何外界支架的支持，更好地模擬了細(xì)胞的體內(nèi)環(huán)境。并且我們成功建立了表達(dá)質(zhì)粒載體的這三種細(xì)胞株，并進(jìn)一步建立3D基質(zhì)凝膠共培養(yǎng)模型，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　在體，我們首先運(yùn)用免疫組織化學(xué)、冰凍切片、石蠟切片、活體‘血管-開(kāi)窗’和血管滲漏試驗(yàn)等方法研究脂多糖對(duì)小鼠血管紋血迷路屏障的影響，我們的研究結(jié)果顯示，LPS可引起血管滲漏。LPS

6、誘發(fā)的局部感染可以改變血管紋血迷路屏障的PC和PVM/M的形態(tài)和特性，影響血迷路屏障的完整性。進(jìn)一步我們結(jié)合熒光實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescence quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)、蛋白印跡(western blot)和透射電鏡(Transmission electron microscope,TEM

7、)等方法觀察LPS對(duì)血管紋血迷路屏障緊密連接相關(guān)蛋白的影響。結(jié)果表明，脂多糖可通過(guò)改變血管紋血迷路屏障組成細(xì)胞PC和PVM/M的形態(tài)和特性，調(diào)控緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響血管紋血迷路屏障的通透性。且與先前報(bào)道結(jié)果相一致，本研究結(jié)果顯示脂多糖可引起高頻聽(tīng)力損失。
　　離體，我們利用原代培養(yǎng)血管紋EC建立EC單層培養(yǎng)模型，脂多糖處理不同時(shí)間，發(fā)現(xiàn)LPS處理組EC單層對(duì)小分子熒光物質(zhì)FITC-dextran的滲透率較正常對(duì)照組明顯升高

8、，更進(jìn)一步我們結(jié)合實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈反應(yīng)，in cell western，免疫細(xì)胞熒光等方法研究脂多糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)的影響，與體內(nèi)研究結(jié)果一致，脂多糖下調(diào) EC間緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá),如 ZO-1, occludin和ve-cadherin。并且我們運(yùn)用3D基質(zhì)凝膠細(xì)胞共培養(yǎng)模型，模擬正常體內(nèi)生理環(huán)境，結(jié)合共聚焦顯微鏡，觀察病理?xiàng)l件下（脂多糖處理）PC和PVM/M對(duì)血管生成和穩(wěn)定性的影響，結(jié)果顯示脂多糖引起PC‘遷移’，激活

9、PVM/M引起形態(tài)學(xué)和性能改變，降低了PC和PVM/M對(duì)血管的生成和穩(wěn)定作用，引起血管網(wǎng)支架不穩(wěn)定，加速血管網(wǎng)支架降解。
　　本研究分為三個(gè)部分：
　　第一部分：小鼠血管紋血迷路屏障的細(xì)胞組成和在血迷路屏障中的分布
　　目的：
　　分析血管紋血迷路屏障的細(xì)胞組成和分布特點(diǎn)，原代培養(yǎng)血管紋 EC、PC和PVM/M并進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，建立穩(wěn)定表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，建立3D細(xì)胞共培養(yǎng)模型，為下一步的功能研究提供基礎(chǔ)依據(jù)。<

10、br>　　方法：
　　分離血管紋，運(yùn)用聚焦離子/電子雙束顯微電鏡(FIB/SEM)技術(shù),獲取高清血管紋血迷路屏障超微結(jié)構(gòu)圖，運(yùn)用先進(jìn)的VolRoverN軟件進(jìn)行3D重建。離體，利用實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的方法從小鼠耳蝸血管紋組織選擇性獲取血迷路屏障EC、PC和PVM/M進(jìn)行原代培養(yǎng)，并分別用三種不同顏色的細(xì)胞熒光探針標(biāo)記三種細(xì)胞系后建立3D懸滴球體共培養(yǎng)模型。進(jìn)一步，用pE2-Crimson-N1質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染EC、pmOrange2-N1

11、載體轉(zhuǎn)染PC、pEGFP-N2載體轉(zhuǎn)染PVM/M，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，凍存?zhèn)溆?，并利用轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞建立體外3D基質(zhì)凝膠共培養(yǎng)模型，為更好研究血迷路屏障提供技術(shù)基礎(chǔ)。
　　結(jié)果：
　　1血管紋血迷路屏障的形態(tài)和構(gòu)成
　　通過(guò) FIB/SEM獲得高清血管紋超微結(jié)構(gòu)圖,細(xì)胞邊緣可以自動(dòng)分割出來(lái)， PVM/M、PC和EC之間的相互作用聯(lián)系被描出和量化，并運(yùn)用先進(jìn)的VolRoverN軟件進(jìn)行3D重建，重建的結(jié)構(gòu)圖清晰顯示三種細(xì)

12、胞的位置關(guān)系，有助于我們更好理解血迷路屏障結(jié)構(gòu)。
　　23D懸滴球體共培養(yǎng)系統(tǒng)建立
　　利用實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的方法，進(jìn)行原代培養(yǎng)血管紋EC、PC和PVM/M，并分別用帶有不同顏色的熒光探針標(biāo)記這三種細(xì)胞，建立3D懸滴球體共培養(yǎng)模型。
　　3成功建立分別表達(dá) pE2-Crimson-N1、pmOrange2-N1、 pEGFP-N2質(zhì)粒載體的三種細(xì)胞株，并利用轉(zhuǎn)染細(xì)胞建立3D基質(zhì)凝膠共培養(yǎng)模型。
　　成功建立表達(dá)pE

13、2-Crimson-N1載體的血管紋EC株,表達(dá)pmOrange2-N1的血管紋PC株,表達(dá)pEGFP-N2載體的血管紋PVM/M株,利用轉(zhuǎn)染細(xì)胞建立3D基質(zhì)凝膠共培養(yǎng)模型。
　　結(jié)論：
　　本文運(yùn)用FIB/SEM獲得了血管紋血迷路屏障的高清超微結(jié)構(gòu)圖，并運(yùn)用先進(jìn)的VolRoverN軟件進(jìn)行3D重建，清晰的顯示三種細(xì)胞的位置關(guān)系，有助于我們更好理解血迷路屏障結(jié)構(gòu)?？梢?jiàn)血迷路屏障除了由基質(zhì)膜和EC構(gòu)成外，該屏障周圍還有大量的周

14、細(xì)胞（pericyte,PC）和血管旁定居的巨噬細(xì)胞樣黑色素細(xì)胞（perivascular resident macrophage，PVM/Ms）。3D懸滴球體共培養(yǎng)模型能更好模擬細(xì)胞的體內(nèi)環(huán)境，更有利于觀察血迷路屏障三種組成細(xì)胞之間的作用關(guān)系。成功建立穩(wěn)定表達(dá)pE2-Crimson-N1載體的血管紋EC株,表達(dá)pmOrange2-N1載體的血管紋PC株,表達(dá)pEGFP-N2載體的PVM/Ms株,利用轉(zhuǎn)染細(xì)胞成功建立了3D基質(zhì)凝膠共培養(yǎng)

15、模型，為我們后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　第二部分：內(nèi)毒素脂多糖對(duì)血迷路屏障影響的在體研究
　　目的：
　　通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討內(nèi)毒素脂多糖對(duì)血迷路屏障的影響及具體作用機(jī)制。
　　方法：
　　通過(guò)鼓膜注射內(nèi)毒素脂多糖建立中耳炎模型，結(jié)合冰凍切片，免疫熒光化學(xué)方法評(píng)估中耳炎模型的建立，通過(guò)活體‘血管-開(kāi)窗’的方法結(jié)合熒光顯微鏡在體觀察內(nèi)耳血迷路屏障對(duì)熒光物質(zhì) albumin-FITC滲透性的變化，分離血管紋，熒光定量分

16、析殘留熒光，比較對(duì)照組和 LPS處理組血管紋血迷路屏障的通透性變化。聽(tīng)性腦干反應(yīng)測(cè)聽(tīng)評(píng)估 LPS處理后聽(tīng)功能狀態(tài)的改變。石蠟切片結(jié)合共聚焦熒光顯微鏡觀察中耳炎模型內(nèi)耳形態(tài)的變化。免疫組織化學(xué)的方法結(jié)合共聚焦熒光顯微鏡，觀察脂多糖對(duì)血管紋血迷路屏障PC和PVM/M的影響。通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈反應(yīng)、蛋白質(zhì)印跡、透射電鏡方法觀察脂多糖對(duì)血管紋緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1, occludin,和VE-cadherin表達(dá)水平的影響。
　　

17、結(jié)果：
　　1脂多糖誘導(dǎo)中耳炎模型的評(píng)估
　　脂多糖導(dǎo)致鼓膜和中耳粘膜增厚水腫，中耳腔和鼓膜大量F4/80陽(yáng)性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　2脂多糖可引起聽(tīng)力損失
　　正常對(duì)照組在所有測(cè)試頻率均顯示出極好的聽(tīng)力閾值。LPS處理組，在多個(gè)測(cè)試頻率都出現(xiàn)聽(tīng)力閾值的明顯升高。
　　3內(nèi)淋巴水腫
　　石蠟切片結(jié)果顯示，正常對(duì)照組耳蝸?lái)斵D(zhuǎn)、中轉(zhuǎn)和底轉(zhuǎn)都未見(jiàn)內(nèi)淋巴水腫， LPS處理組耳蝸?lái)斵D(zhuǎn)和中轉(zhuǎn)見(jiàn)輕度內(nèi)淋巴水腫，Reis

18、sner’s膜處可見(jiàn)褶皺。
　　4脂多糖對(duì)血迷路屏障通透性的影響
　　脂多糖導(dǎo)致血迷路屏障高通透性。正常對(duì)照組，活體熒光顯微鏡下未見(jiàn)血管網(wǎng)albumin-FITC滲出，LPS處理組血管網(wǎng)見(jiàn)多處albumin-FITC滲出。分離整個(gè)血管紋，LPS處理組albumin-FITC殘留比正常對(duì)照組顯著升高。
　　5脂多糖引起PC遷移和PVM/M的激活從而影響血管紋血迷路屏障完整性。
　　正常對(duì)照組，PC展示出扁平、細(xì)長(zhǎng)的

19、形態(tài)且與EC緊密接觸；而在LPS處理組，PC呈明顯的圓形胞體，可見(jiàn)有細(xì)胞遷移脫離血管壁，并釋放大量顆粒。PVM/M在正常小鼠呈現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)樹(shù)枝狀，細(xì)胞膜表面無(wú)終端半乳糖基團(tuán)的附著， GS-IB4陰性。然而48小時(shí)LPS處理后，細(xì)胞突起縮短，一些細(xì)胞變性，類似變形蟲(chóng)樣形態(tài)，部分細(xì)胞被激活，與GS-IB4緊密結(jié)合，GS-IB4陽(yáng)性。
　　6脂多糖對(duì)血管紋血迷路屏障緊密連接蛋白表達(dá)的影響。
　　mRNA水平，血管紋內(nèi) ZO-1、occl

20、udin和 VE-cadherin表達(dá)水平脂多糖處理48小時(shí)后較正常對(duì)照組明顯減低(n=3; P<0.01)，mRNA表達(dá)降低的同時(shí)，western blot結(jié)果顯示蛋白表達(dá)水平同樣也顯著降低(n=3;P<0.05)。
　　7透射電鏡下緊密連接形態(tài)學(xué)改變
　　透射電鏡下見(jiàn)正常對(duì)照組血管紋 EC之間廣泛、致密的緊密連接，而 LPS處理組緊密連接明顯減少。
　　結(jié)論：
　　1．脂多糖可引起聽(tīng)力損傷。
　　2．脂

21、多糖導(dǎo)致內(nèi)淋巴水腫。
　　3．脂多糖誘發(fā)的中耳炎癥下調(diào)緊密連接蛋白ZO-1，occludin，和VE-cadherin的表達(dá)，引起血迷路屏障組成細(xì)胞周細(xì)胞的遷移和血管旁定居的巨噬細(xì)胞樣黑色素細(xì)胞的激活，導(dǎo)致周細(xì)胞和血管旁定居的巨噬細(xì)胞樣黑色素細(xì)胞的形態(tài)和特性改變，破壞血迷路屏障的完整性，引起血管滲漏，破壞內(nèi)耳平衡，參與血迷路屏障通透性增高的發(fā)病機(jī)制。
　　第三部分：內(nèi)毒素脂多糖對(duì)血迷路屏障影響的離體研究
　　目的：

22、r>　　通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討內(nèi)毒素脂多糖對(duì)血迷路屏障的影響及具體作用機(jī)制。
　　方法：
　　復(fù)蘇前述凍存的三類血迷路屏障來(lái)源的細(xì)胞，運(yùn)用EC建立體外EC單層模型，離體觀察脂多糖作用下EC單層對(duì)熒光物質(zhì)FITC-dextran通透性的變化。并利用細(xì)胞免疫熒光的方法結(jié)合共聚焦熒光顯微鏡觀察脂多糖對(duì)這三種細(xì)胞的影響，建立3D基質(zhì)凝膠共培養(yǎng)模型，模擬正常體內(nèi)生理環(huán)境，結(jié)合共聚焦顯微鏡，觀察病理?xiàng)l件下（脂多糖處理）PC和PVM/M對(duì)血管生

23、成和穩(wěn)定性的影響。利用原代培養(yǎng)的EC建立體外EC單層模型，結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)、蛋白質(zhì)印跡和熒光實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈反應(yīng)等方法觀察脂多糖對(duì)緊密連接蛋白 ZO-1, occludin,和VE-cadherin表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果：
　　1脂多糖對(duì)血管紋EC單細(xì)胞層通透性的影響
　　利用實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的方法培養(yǎng)EC并建立EC單細(xì)胞層模型，LPS處理結(jié)果顯示，處理2h即開(kāi)始出現(xiàn) FITC-dextran滲透率增高，隨著時(shí)間延長(zhǎng)

24、， FITC-dextran滲透率逐漸增高。
　　2脂多糖導(dǎo)致PC和血管旁定居的巨噬細(xì)胞樣黑色素細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。
　　正常PC呈個(gè)大、扁平具有寬偽足的星形形態(tài)，而經(jīng)LPS處理后PC分支增多，并釋放大量的顆粒。與在體結(jié)果相一致，LPS處理后血管旁定居的巨噬細(xì)胞樣黑色素細(xì)胞細(xì)胞突起變短，部分細(xì)胞被激活， GS-IB4陽(yáng)性.
　　3脂多糖降低了 PC和血管旁定居的巨噬細(xì)胞樣黑色素細(xì)胞對(duì)血管的生成和穩(wěn)定作用。
　　正常組

25、PC與EC形成的‘血管網(wǎng)’緊密相貼，未見(jiàn)細(xì)胞遷移，LPS處理組，見(jiàn)PC脫離‘血管支架’，發(fā)生遷移。正常組，PVM/M，從胞體發(fā)出細(xì)長(zhǎng)的突起，緊緊包繞EC形成的‘血管網(wǎng)’，血管支架穩(wěn)定，LPS組，突起縮短，胞體變小，支架不穩(wěn)定，‘血管網(wǎng)’支架破壞。
　　4脂多糖對(duì)EC單層緊密連接蛋白表達(dá)的影響。
　　在mRNA水平，occludin和 VE-cadherin在LPS2h組、8h組和24h組較正常對(duì)照組均明顯降低，zo-1mRN

26、A表達(dá)水平在LPS8h和LPS24h組明顯降低。mRNA表達(dá)水平降低的同時(shí)，in cell western結(jié)果顯示三者在LPS24h組蛋白水平的表達(dá)同樣有顯著降低。此外,共聚焦顯微鏡拍攝的免疫組化照片清楚的顯示LPS處理下 EC單細(xì)胞層模型細(xì)胞之間的緊密連接相關(guān)蛋白密度明顯降低，EC之間的間隙變大。
　　結(jié)論：
　　1脂多糖可引起 PC‘遷移’，激活血管旁定居的巨噬細(xì)胞樣黑色素細(xì)胞,引起細(xì)胞形態(tài)和性能改變，降低了PC和PVM