地塞米松對膠質(zhì)瘤性腦水腫及血腫瘤屏障通透性影響機制的研究.pdf

1、目的： 膠質(zhì)瘤性腦水腫是膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過程中一個重要的病理生理變化。它不僅與許多膠質(zhì)瘤患者臨床癥狀的產(chǎn)生密切相關，同時，它所導致的顱內(nèi)壓升高是造成膠質(zhì)瘤患者預后不良及死亡的重要原因。地塞米松的應用使膠質(zhì)瘤患者死亡率顯著下降，這與它能快速降低腦水腫及修復受損的血腦屏障密切相關，然而，地塞米松降低腦水腫、修復血腦屏障的分子機制仍然不十分清楚。 水通道蛋白(AQPs)是最近發(fā)現(xiàn)的一組與水通透性有關的細胞膜轉(zhuǎn)運蛋白，它是生物膜水

2、轉(zhuǎn)運的分子基礎，而在血腦屏障的星形膠質(zhì)細胞血管終足上大量表達的AQP4蛋白，是決定血腦屏障水轉(zhuǎn)運的重要因素。研究中發(fā)現(xiàn)在細胞毒性腦水腫模型中敲除AQP4基因大鼠，其水腫程度和顱內(nèi)壓明顯減輕，而在血管源性腦水腫模型中敲除AQP4基因大鼠，水腫程度和顱內(nèi)壓則明顯增高。從基因敲除的模型研究中可以看出腦組織中AQP4蛋白具有雙向水轉(zhuǎn)運功能，弄清AQP4蛋白在腦水腫中的作用及表達調(diào)控機制，對于研制腦水腫的有效治療方法是十分必要的。 研究證

3、實AQP4蛋白在腦腫瘤組織水腫的調(diào)節(jié)代謝中起重要作用。地塞米松是臨床上降低腫瘤性腦水腫的常規(guī)用藥，我們最近研究發(fā)現(xiàn)地塞米松能下調(diào)腦出血大鼠腦組織AQP4蛋白的表達，降低出血性腦水腫的產(chǎn)生，但地塞米松是否通過調(diào)節(jié)腫瘤大鼠腦組織AQP4蛋白表達降低膠質(zhì)瘤性腦水腫尚未見報道。AQP4蛋白存在于血腦屏障上，參與血腦屏障的形成，雞胚發(fā)育9天時腦組織中未發(fā)現(xiàn)，14天時少量表達，20天時達到成熟水平，表明腦組織AQP4蛋白表達與血腦屏障的成熟過程一致

4、。脂多糖模擬血腦屏障損傷后，腦組織AQP4蛋白表達上調(diào)，研究證實腦損傷性疾病伴有血腦屏障損傷時AQP4蛋白表達顯著上調(diào)，而沒有血腦屏障損傷的腦組織AQP4蛋白表達無顯著改變，提示瘤周腦組織AQP4蛋白表達的改變可能與腦水腫和血腦屏障的通透性改變有關。最近，一些研究報道腦組織中表達的AQP4蛋白作為滲透壓感受器，在腦的滲透壓感受區(qū)域表達，對于水的集聚起重要作用。在第三腦室周圍的下丘腦區(qū)AQP4蛋白表達上調(diào)能促進水的排出和腦脊液的產(chǎn)生。上述

5、研究表明AQP4蛋白參與滲透壓平衡和血腦屏障完整性的調(diào)節(jié)。以往的研究證實地塞米松能促進血腦屏障完整性的恢復，減少炎癥細胞因子產(chǎn)生，進而減少滲透壓的改變。而AQP4蛋白促進腦損傷處水的吸收和損傷遠端水的排出。因此，我們推測地塞米松通過調(diào)節(jié)不同腦區(qū)AQP4蛋白的表達，促進水腫液從腦腫瘤周圍區(qū)向遠端第三腦室腦區(qū)清除，進而維持腫瘤近端腦區(qū)和遠端腦區(qū)間滲透壓的平衡。 膠質(zhì)瘤性腦水腫病人血腦屏障通透性增加，而地塞米松能降低血腫瘤屏障的通透性

6、，但是地塞米松降低血腫瘤屏障通透性的分子機制尚不完全清楚。血腦屏障是由血管內(nèi)皮細胞、基膜和星形膠質(zhì)細胞血管終足構成的。正常的腦血管內(nèi)皮細胞缺乏轉(zhuǎn)運囊泡、內(nèi)皮問存在連續(xù)的緊密連接。腦膠質(zhì)瘤病人的腦血管內(nèi)皮細胞被腫瘤破壞，腫瘤血管內(nèi)皮細胞的超微結構顯示：轉(zhuǎn)運囊泡增加，細胞水腫和緊密連接破壞，即細胞旁通路和跨細胞通路開放。研究發(fā)現(xiàn)地塞米松應用7天后腦水腫的減輕與血腫瘤屏障通透性降低相關，在培養(yǎng)的正常腦血管內(nèi)皮細胞里，地塞米松導致腦血管內(nèi)皮細胞

7、上緊密連接相關蛋白occluding和ZO-1的上調(diào)和去磷酸化。我們推測地塞米松可能通過調(diào)節(jié)血腫瘤屏障上的緊密連接相關蛋白occluding表達降低血腫瘤屏障的通透性。 跨細胞轉(zhuǎn)運是藥物通過血腫瘤屏障的又一重要途徑，主要通過增加囊泡轉(zhuǎn)運導致血腫瘤屏障通透性增強，關于地塞米松對跨細胞轉(zhuǎn)運途徑的影響，目前尚未見報道。血腫瘤屏障上的ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitivc potassium channel，KATPchanne

8、l)和鈣離子激活性鉀通道(Calcium-activated potassium channel，Kca channel)是血腫瘤屏障上跨細胞途徑的兩個重要靶點，它能有效地誘導腦腫瘤血管內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞上轉(zhuǎn)運囊泡的加速形成。研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞上的鉀通道是糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)的重要靶點。地塞米松可以調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞上的KATP通道，可通過絲氨酸蘇氨酸蛋白磷酸酶和蛋白激酶A調(diào)節(jié)腦垂體CH3和AtT-20細胞上的Kca通道活動，我們推測地塞米

9、松可能通過調(diào)節(jié)腦腫瘤組織的KATp通道和Kca通道參與跨細胞轉(zhuǎn)運的調(diào)節(jié)。 地塞米松降低腦水腫是否與調(diào)節(jié)不同腦區(qū)AQP4蛋白表達有關?地塞米松對血腫瘤屏障的通透性影響的分子機制是什么?這些問題目前尚不清楚亟待解決。 方法： 1、復制大鼠C6膠質(zhì)瘤模型。收集培養(yǎng)的C6膠質(zhì)瘤細胞1×106/10μl，通過立體定位儀種于動物大腦右側尾狀核，約14天形成荷瘤鼠。 2、應用干濕重法檢測地塞米松給藥前后C6膠質(zhì)瘤大鼠腦

10、組織含水量的變化。 3、應用免疫熒光法檢測地塞米松給藥前后C6膠質(zhì)瘤大鼠不同腦區(qū)AQP4蛋白的分布和表達水平的變化。 4、應用RT-PCR法，Western blot法分別檢測地塞米松給藥前后C6膠質(zhì)瘤大鼠不同腦區(qū)AQP4mRNA和蛋白表達的變化。 5、應用伊文思蘭法(Evans blue，EB)檢測地塞米松、緩激肽及地塞米松與緩激肽聯(lián)合應用后C6膠質(zhì)瘤大鼠血腫瘤屏障通透性的變化。 6、應用Western

11、 blot法檢測地塞米松、緩激肽及地塞米松與緩激肽聯(lián)合應用后C6膠質(zhì)瘤大鼠腦腫瘤組織緊密連接相關蛋白occluding、KATP通道的Kir6.2亞基，Kca通道的α-亞單位表達的變化。 7、應用免疫組織化學法檢測地塞米松、緩激肽及地塞米松與緩激肽聯(lián)合應用后C6膠質(zhì)瘤大鼠腦腫瘤組織KATP,通道的Kir6.2亞基，Kca通道的α-亞單位表達的變化。 8、應用全細胞膜片鉗技術檢測地塞米松、緩激肽及地塞米松與緩激肽聯(lián)合應用后

12、大鼠C6細胞的IKATP，IKca電流的變化。 結果： 1、成功建立了大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型。 2、地塞米松作用后，C6膠質(zhì)瘤大鼠腦組織含水量顯著降低。 3、AQP4蛋白在正常腦組織中表達于星形膠質(zhì)細胞血管終足上，在C6膠質(zhì)瘤大鼠瘤周水腫區(qū)腦組織中表達顯著增多呈彌漫性分布。 4、地塞米松作用1天后，C6膠質(zhì)瘤大鼠瘤周水腫區(qū)腦組織AQP4mRNA表達顯著下調(diào)，地塞米松作用3天后，該區(qū)腦組織AQP4蛋白

13、表達顯著下調(diào)。 5、地塞米松作用1天后，C6膠質(zhì)瘤大鼠第三腦室周圍的下丘腦區(qū)腦組織AQP4mRNA表達水平顯著增加，地塞米松作用3天后，該區(qū)腦組織AQP4蛋白水平顯著增加。 6、地塞米松作用3天后，C6膠質(zhì)瘤大鼠血腫瘤屏障通透性顯著降低。 7、地塞米松作用3天后，C6膠質(zhì)瘤大鼠腦腫瘤組織緊密連接相關蛋白occluding表達顯著增加。 8、地塞米松作用3天后，C6膠質(zhì)瘤大鼠腦腫瘤組織中KATP通道的Kir

14、6.2亞基表達顯著增加，但大鼠C6細胞的IKATP電流密度無顯著增加。 9、地塞米松作用3天后，C6膠質(zhì)瘤大鼠腫瘤組織中Kca通道的α-亞單位表達顯著增加，但大鼠C6細胞的IKCa 電流密度無顯著增加。 10、地塞米松作用3天后，緩激肽誘導的大鼠腫瘤細胞IKCa電流密度、IKATP電流密度顯著增加。 結論： 1、C6腦膠質(zhì)瘤大鼠瘤周水腫區(qū)腦組織中AQP4蛋白表達上調(diào)，但第三腦室下丘腦區(qū)的AQP4蛋白表達未

15、見改變。 2、地塞米松下調(diào)C6腦膠質(zhì)瘤大鼠瘤周水腫區(qū)腦組織中AQP4蛋白表達，上調(diào)第三腦室區(qū)腦組織中AQP4蛋白表達。 3、地塞米松上調(diào)C6腦膠質(zhì)瘤大鼠腫瘤組織中緊密連接蛋白occluding表達。 4、地塞米松上調(diào)C6腦膠質(zhì)瘤大鼠腫瘤組織中KATP，KCa道的蛋白表達。 5、地塞米松增強緩激肽誘導的大鼠腫瘤細胞IKCa電流密度和IKATP電流密度。 6、地塞米松降低血腫瘤屏障通透性，但未抑制緩激