地塞米松對(duì)膠質(zhì)瘤性腦水腫及血腫瘤屏障通透性影響機(jī)制的研究.pdf

1、目的： 膠質(zhì)瘤性腦水腫是膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中一個(gè)重要的病理生理變化。它不僅與許多膠質(zhì)瘤患者臨床癥狀的產(chǎn)生密切相關(guān)，同時(shí)，它所導(dǎo)致的顱內(nèi)壓升高是造成膠質(zhì)瘤患者預(yù)后不良及死亡的重要原因。地塞米松的應(yīng)用使膠質(zhì)瘤患者死亡率顯著下降，這與它能快速降低腦水腫及修復(fù)受損的血腦屏障密切相關(guān)，然而，地塞米松降低腦水腫、修復(fù)血腦屏障的分子機(jī)制仍然不十分清楚。 水通道蛋白(AQPs)是最近發(fā)現(xiàn)的一組與水通透性有關(guān)的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它是生物膜水

2、轉(zhuǎn)運(yùn)的分子基礎(chǔ)，而在血腦屏障的星形膠質(zhì)細(xì)胞血管終足上大量表達(dá)的AQP4蛋白，是決定血腦屏障水轉(zhuǎn)運(yùn)的重要因素。研究中發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞毒性腦水腫模型中敲除AQP4基因大鼠，其水腫程度和顱內(nèi)壓明顯減輕，而在血管源性腦水腫模型中敲除AQP4基因大鼠，水腫程度和顱內(nèi)壓則明顯增高。從基因敲除的模型研究中可以看出腦組織中AQP4蛋白具有雙向水轉(zhuǎn)運(yùn)功能，弄清AQP4蛋白在腦水腫中的作用及表達(dá)調(diào)控機(jī)制，對(duì)于研制腦水腫的有效治療方法是十分必要的。 研究證

3、實(shí)AQP4蛋白在腦腫瘤組織水腫的調(diào)節(jié)代謝中起重要作用。地塞米松是臨床上降低腫瘤性腦水腫的常規(guī)用藥，我們最近研究發(fā)現(xiàn)地塞米松能下調(diào)腦出血大鼠腦組織AQP4蛋白的表達(dá)，降低出血性腦水腫的產(chǎn)生，但地塞米松是否通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤大鼠腦組織AQP4蛋白表達(dá)降低膠質(zhì)瘤性腦水腫尚未見報(bào)道。AQP4蛋白存在于血腦屏障上，參與血腦屏障的形成，雞胚發(fā)育9天時(shí)腦組織中未發(fā)現(xiàn)，14天時(shí)少量表達(dá)，20天時(shí)達(dá)到成熟水平，表明腦組織AQP4蛋白表達(dá)與血腦屏障的成熟過(guò)程一致

4、。脂多糖模擬血腦屏障損傷后，腦組織AQP4蛋白表達(dá)上調(diào)，研究證實(shí)腦損傷性疾病伴有血腦屏障損傷時(shí)AQP4蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，而沒(méi)有血腦屏障損傷的腦組織AQP4蛋白表達(dá)無(wú)顯著改變，提示瘤周腦組織AQP4蛋白表達(dá)的改變可能與腦水腫和血腦屏障的通透性改變有關(guān)。最近，一些研究報(bào)道腦組織中表達(dá)的AQP4蛋白作為滲透壓感受器，在腦的滲透壓感受區(qū)域表達(dá)，對(duì)于水的集聚起重要作用。在第三腦室周圍的下丘腦區(qū)AQP4蛋白表達(dá)上調(diào)能促進(jìn)水的排出和腦脊液的產(chǎn)生。上述

5、研究表明AQP4蛋白參與滲透壓平衡和血腦屏障完整性的調(diào)節(jié)。以往的研究證實(shí)地塞米松能促進(jìn)血腦屏障完整性的恢復(fù)，減少炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生，進(jìn)而減少滲透壓的改變。而AQP4蛋白促進(jìn)腦損傷處水的吸收和損傷遠(yuǎn)端水的排出。因此，我們推測(cè)地塞米松通過(guò)調(diào)節(jié)不同腦區(qū)AQP4蛋白的表達(dá)，促進(jìn)水腫液從腦腫瘤周圍區(qū)向遠(yuǎn)端第三腦室腦區(qū)清除，進(jìn)而維持腫瘤近端腦區(qū)和遠(yuǎn)端腦區(qū)間滲透壓的平衡。 膠質(zhì)瘤性腦水腫病人血腦屏障通透性增加，而地塞米松能降低血腫瘤屏障的通透性

6、，但是地塞米松降低血腫瘤屏障通透性的分子機(jī)制尚不完全清楚。血腦屏障是由血管內(nèi)皮細(xì)胞、基膜和星形膠質(zhì)細(xì)胞血管終足構(gòu)成的。正常的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞缺乏轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡、內(nèi)皮問(wèn)存在連續(xù)的緊密連接。腦膠質(zhì)瘤病人的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞被腫瘤破壞，腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)顯示：轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡增加，細(xì)胞水腫和緊密連接破壞，即細(xì)胞旁通路和跨細(xì)胞通路開放。研究發(fā)現(xiàn)地塞米松應(yīng)用7天后腦水腫的減輕與血腫瘤屏障通透性降低相關(guān)，在培養(yǎng)的正常腦血管內(nèi)皮細(xì)胞里，地塞米松導(dǎo)致腦血管內(nèi)皮細(xì)胞

7、上緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccluding和ZO-1的上調(diào)和去磷酸化。我們推測(cè)地塞米松可能通過(guò)調(diào)節(jié)血腫瘤屏障上的緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccluding表達(dá)降低血腫瘤屏障的通透性。 跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)是藥物通過(guò)血腫瘤屏障的又一重要途徑，主要通過(guò)增加囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)導(dǎo)致血腫瘤屏障通透性增強(qiáng)，關(guān)于地塞米松對(duì)跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的影響，目前尚未見報(bào)道。血腫瘤屏障上的ATP敏感性鉀通道(ATP-sensitivc potassium channel，KATPchanne

8、l)和鈣離子激活性鉀通道(Calcium-activated potassium channel，Kca channel)是血腫瘤屏障上跨細(xì)胞途徑的兩個(gè)重要靶點(diǎn)，它能有效地誘導(dǎo)腦腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞上轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡的加速形成。研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞上的鉀通道是糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)的重要靶點(diǎn)。地塞米松可以調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞上的KATP通道，可通過(guò)絲氨酸蘇氨酸蛋白磷酸酶和蛋白激酶A調(diào)節(jié)腦垂體CH3和AtT-20細(xì)胞上的Kca通道活動(dòng)，我們推測(cè)地塞米

9、松可能通過(guò)調(diào)節(jié)腦腫瘤組織的KATp通道和Kca通道參與跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)。 地塞米松降低腦水腫是否與調(diào)節(jié)不同腦區(qū)AQP4蛋白表達(dá)有關(guān)?地塞米松對(duì)血腫瘤屏障的通透性影響的分子機(jī)制是什么?這些問(wèn)題目前尚不清楚亟待解決。 方法： 1、復(fù)制大鼠C6膠質(zhì)瘤模型。收集培養(yǎng)的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞1×106/10μl，通過(guò)立體定位儀種于動(dòng)物大腦右側(cè)尾狀核，約14天形成荷瘤鼠。 2、應(yīng)用干濕重法檢測(cè)地塞米松給藥前后C6膠質(zhì)瘤大鼠腦

10、組織含水量的變化。 3、應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)地塞米松給藥前后C6膠質(zhì)瘤大鼠不同腦區(qū)AQP4蛋白的分布和表達(dá)水平的變化。 4、應(yīng)用RT-PCR法，Western blot法分別檢測(cè)地塞米松給藥前后C6膠質(zhì)瘤大鼠不同腦區(qū)AQP4mRNA和蛋白表達(dá)的變化。 5、應(yīng)用伊文思蘭法(Evans blue，EB)檢測(cè)地塞米松、緩激肽及地塞米松與緩激肽聯(lián)合應(yīng)用后C6膠質(zhì)瘤大鼠血腫瘤屏障通透性的變化。 6、應(yīng)用Western

11、 blot法檢測(cè)地塞米松、緩激肽及地塞米松與緩激肽聯(lián)合應(yīng)用后C6膠質(zhì)瘤大鼠腦腫瘤組織緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccluding、KATP通道的Kir6.2亞基，Kca通道的α-亞單位表達(dá)的變化。 7、應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)地塞米松、緩激肽及地塞米松與緩激肽聯(lián)合應(yīng)用后C6膠質(zhì)瘤大鼠腦腫瘤組織KATP,通道的Kir6.2亞基，Kca通道的α-亞單位表達(dá)的變化。 8、應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)地塞米松、緩激肽及地塞米松與緩激肽聯(lián)合應(yīng)用后

12、大鼠C6細(xì)胞的IKATP，IKca電流的變化。 結(jié)果： 1、成功建立了大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型。 2、地塞米松作用后，C6膠質(zhì)瘤大鼠腦組織含水量顯著降低。 3、AQP4蛋白在正常腦組織中表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞血管終足上，在C6膠質(zhì)瘤大鼠瘤周水腫區(qū)腦組織中表達(dá)顯著增多呈彌漫性分布。 4、地塞米松作用1天后，C6膠質(zhì)瘤大鼠瘤周水腫區(qū)腦組織AQP4mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，地塞米松作用3天后，該區(qū)腦組織AQP4蛋白

13、表達(dá)顯著下調(diào)。 5、地塞米松作用1天后，C6膠質(zhì)瘤大鼠第三腦室周圍的下丘腦區(qū)腦組織AQP4mRNA表達(dá)水平顯著增加，地塞米松作用3天后，該區(qū)腦組織AQP4蛋白水平顯著增加。 6、地塞米松作用3天后，C6膠質(zhì)瘤大鼠血腫瘤屏障通透性顯著降低。 7、地塞米松作用3天后，C6膠質(zhì)瘤大鼠腦腫瘤組織緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccluding表達(dá)顯著增加。 8、地塞米松作用3天后，C6膠質(zhì)瘤大鼠腦腫瘤組織中KATP通道的Kir

14、6.2亞基表達(dá)顯著增加，但大鼠C6細(xì)胞的IKATP電流密度無(wú)顯著增加。 9、地塞米松作用3天后，C6膠質(zhì)瘤大鼠腫瘤組織中Kca通道的α-亞單位表達(dá)顯著增加，但大鼠C6細(xì)胞的IKCa 電流密度無(wú)顯著增加。 10、地塞米松作用3天后，緩激肽誘導(dǎo)的大鼠腫瘤細(xì)胞IKCa電流密度、IKATP電流密度顯著增加。 結(jié)論： 1、C6腦膠質(zhì)瘤大鼠瘤周水腫區(qū)腦組織中AQP4蛋白表達(dá)上調(diào)，但第三腦室下丘腦區(qū)的AQP4蛋白表達(dá)未

15、見改變。 2、地塞米松下調(diào)C6腦膠質(zhì)瘤大鼠瘤周水腫區(qū)腦組織中AQP4蛋白表達(dá)，上調(diào)第三腦室區(qū)腦組織中AQP4蛋白表達(dá)。 3、地塞米松上調(diào)C6腦膠質(zhì)瘤大鼠腫瘤組織中緊密連接蛋白o(hù)ccluding表達(dá)。 4、地塞米松上調(diào)C6腦膠質(zhì)瘤大鼠腫瘤組織中KATP，KCa道的蛋白表達(dá)。 5、地塞米松增強(qiáng)緩激肽誘導(dǎo)的大鼠腫瘤細(xì)胞IKCa電流密度和IKATP電流密度。 6、地塞米松降低血腫瘤屏障通透性，但未抑制緩激