內(nèi)皮屏障抗原在實驗性大鼠腦出血后表達及對血腦屏障通透性的影響.pdf

1、目的：
　　 腦出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)是指非外傷性腦實質(zhì)出血,是一種神經(jīng)系統(tǒng)常見病、多發(fā)病,其致殘率和死亡率均很高,嚴(yán)重影響人類的健康和患者的生存質(zhì)量。ICH后腦水腫是腦損傷加重的主要因為之一,如果誘發(fā)腦疝還可導(dǎo)致患者死亡。目前的治療方法僅局限于脫水治療如高滲性脫水劑和利尿劑、外科手術(shù)減壓治療等,尚無特效治療。內(nèi)皮屏障抗原(Endothelial Barrier Antigen,EBA)

2、是一種主要在具有血腦屏障(Blood-brain barrier,BBB)特性的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上特異性表達,由相對分子量分別為32kDa、25kDa和23.5kDa三個亞基組成的三聚體蛋白質(zhì)。EBA在各種因為(如腦缺血、蛛網(wǎng)膜下腔出血、腦外傷等)引起的腦水腫形成中均起著重要的作用。本研究利用立體定向技術(shù)向大鼠尾狀核內(nèi)注入50u L自體股動脈血建立腦出血模型,用免疫組化法檢測腦出血后的血腫周圍腦組織EBA和Fibrinogen動態(tài)表達變

3、化、BBB的通透性及腦水含量的變化,探討EBA在ICH后是否在腦出血后血腫周圍腦組織表達及分布；EBA在ICH后腦水腫形成中的作用機制；從而探討在腦出血后繼發(fā)損傷(主要指腦水腫)中的作用。
　　 材料與方法
　　 一、材料
　　 1、動物分組
　　 選擇健康雄性Sprague Dawley大鼠150只,體重250-300g,隨機分成(1)正常對照組(2)假手術(shù)對照組(3)生理鹽水對照(4)腦出血實驗組,(

4、3)(4)組分別按6h、1d、3d、7d分為4個亞組,每個亞組15只大鼠。
　　 2、主要儀器
　　 動物頭顱立體定位儀、電子分析天平、顯微圖像分析儀、紫外分光光度儀、微量進樣器、高溫干燥箱、組織勻漿機、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)。
　　 3、主要試劑
　　 伊文思蘭、甲酰胺、EBA兔抗鼠多克隆抗體、Fibrinogen羊抗鼠多克隆抗體、即用型SABC免疫組化試劑盒、DAB試劑盒三羥甲基氨基甲烷(Tris)

5、、丙烯酰胺(Acr)、甲醇。
　　 4、大鼠腦出血模型制作
　　 用微量注射器抽取70uL大鼠自體股動脈血。立即將大鼠俯臥位于腦立體定位儀上,于前囟前0.2mm,中線右旁3.0mm,進針約6mm(大鼠尾狀核處),將大鼠自體股動脈血50uL緩慢推注入腦。生理鹽水對照組注入50uL生理鹽水。假手術(shù)對照組鉆孔不進行注射。正常對照組不予任何處置。
　　 5、標(biāo)本制作
　　 (1)取各組5只大鼠于術(shù)后相應(yīng)時間點麻醉

6、,斷頭取腦,進行腦組織水含量測定和BBB通透性測定。
　　 (2)取各組5只大鼠于術(shù)后相應(yīng)時間點麻醉開胸,迅速暴露心臟,4％多聚甲醛灌注固定,取腦,樣本置于4％多聚甲醛外固定4小時,酒精脫水,二甲苯透明,浸蠟,包埋。連續(xù)冠狀切片,片厚5um,進行切片HE染色和免疫組化染色。
　　 (3)取各組5只大鼠于術(shù)后相應(yīng)時間點麻醉,斷頭取腦,進行Fibrinogen蛋白Western Blot檢測。
　　 二、檢測指標(biāo)

7、r>　　 1、腦組織水含量測定
　　 取大鼠出血側(cè)針孔前側(cè)腦組織,按照干濕重法測定腦水含量,計算公式為:腦組織含水量(％)=(濕重-干重)/濕重×100％。以腦組織水含量代表腦水腫的程度。
　　 2、BBB通透性測定
　　 取大鼠出血側(cè)針孔后側(cè)水腫區(qū)腦組織,按Belayev法使用伊文思蘭(Evensblue,EB)測定BBB通透性。用EB含量(OD/mg)表示BBB通透性。
　　 3、EBA蛋白、Fib

8、rinogen蛋白表達免疫組化檢測
　　 SABC法進行EBA蛋白、Fibrinogen蛋白表達陽性細(xì)胞測定。切片經(jīng)過熱修復(fù)后滴加50uL-抗工作液(兔抗鼠多克隆EBA抗體,稀釋度1:200、羊抗鼠多克隆Fibrinogen,稀釋度1:50),4℃過夜；然后滴加生物素化山羊抗兔IgG,過氧化物酶標(biāo)記兔抗羊IgG,37℃ 30min；滴加SABC,37℃30min,各步驟用PBS洗3 min×3次；DAB顯色劑,蘇木素輕度復(fù)染,脫

9、水、透明、封片。顯微圖像分析系統(tǒng)采集圖像,分析陽性細(xì)胞積分光密度。
　　 4、Fibrinogen蛋白Western Blot檢測
　　 取出標(biāo)本100mg低溫提取蛋白,SDS-PAGE分離樣品。轉(zhuǎn)膜,封閉,加-抗(羊抗鼠多克隆Fibrinogen,稀釋度1:100)孵育,洗滌,加二抗后再孵育,洗滌,顯色,攝片。
　　 三、統(tǒng)計分析
　　 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±SD)表示,采用SPSS16.0及

10、Excel統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理,組間比較用單因素方差分析(ANOVA),在單因素方差分析有意義的基礎(chǔ)上再進行組間兩兩比較,兩變量之間相關(guān)關(guān)系行Spearman相關(guān)分析,P<0.05為差異顯著。
　　 結(jié)果：
　　 1、腦水含量測定
　　 大鼠實驗性ICH后腦水含量均增高,6h開始升高,3d時達高峰,7d時逐漸降低,但是與對照組相比仍有顯著差異(P<0.05)。
　　 2、腦組織EB含量測定
　　

11、大鼠實驗性ICH后腦組織EB的含量增加,6h時即明顯升高,3d時達到最高,7d組逐漸降低,但是與對照組相比仍有顯著差異(P<0.05)。
　　 3、大鼠實驗性ICH后EBA蛋白表達
　　 正常對照組大鼠皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞膜EBA呈強陽性表達,假手術(shù)對照組和生理鹽水對照組。腦出血后6h組在血腫周圍和同側(cè)皮質(zhì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞膜EBA表達減少:腦出血后1d組EBA.表達水平明顯減少；腦出血3d組EBA表達顯著減少；腦出血后7d組

12、較3d組的EBA表達增加,但是仍低于6h和1d組。
　　 4、大鼠實驗性ICH后微血管周圍Fibrinogen蛋白表達
　　 正常對照組大鼠皮質(zhì)微血管周圍未見Fibrinogen表達,假手術(shù)對照組和生理鹽水對照組Fibrinogen表達升高,但與正常組比較無顯著差異。腦出血后6h在血腫周圍大腦皮質(zhì)有Fibrinogen弱陽性表達,陽性部位主要為微血管周圍。1d組Fibdnogen表達水平明顯增加。腦出血后3d達高峰,著色

13、最深。7d后Fibrinogen表達水平逐漸降低,但較對照組仍有顯著差異(P<0.05)。
　　 5、Western blot檢測Fibrinogen蛋白表達
　　 正常對照組幾乎未見Fibrinogen表達,假手術(shù)對照組和生理鹽水對照組Fibrinogen表達與正常組比較無顯著差異。腦出血后各組均可在34KD處見Fibrinogen蛋白表達條帶。6h組有Fibrinogen弱陽性表達,1d和3d組Fibrinogen表

14、達逐漸增加,3d達高峰,7d時Fibrinogen表達水平逐漸降低,但較對照組仍有顯著差異(P<0.05)。
　　 討論
　　 在本實驗中采用向大鼠右側(cè)尾狀核內(nèi)注射自體股動脈血制作腦出血模型,通過免疫組化法對EBA進行檢測,發(fā)現(xiàn)出血后的大鼠腦組織中EBA的動態(tài)表達。另外,本實驗對ICH后BBB的通透性分別采用外源性示蹤劑(EB)和內(nèi)源性示蹤劑(Fibrinogen)兩種方法進行了測量,進一步證實內(nèi)源性示蹤劑的準(zhǔn)確性和可靠

15、性。近年來,許多實驗研究都證實,EBA參與了各種因為引發(fā)的腦水腫的發(fā)生和發(fā)展。本試驗結(jié)果示,腦出血組與對照組相比,EBA的表達在6h開始減少,1d和3d組EBA表達水平逐漸減少,3d時EBA表達最少,以后表達逐漸恢復(fù),7d組較前有恢復(fù)。而BBB通透性的變化規(guī)律與腦水含量的測定則與之相反,ICH后6h可見輕度升高,1d-3d逐漸升高,3d時達到高峰,之后逐漸下降,7d時仍高于正常水平。即BBB通透性和腦水腫的程度呈正相關(guān),EBA的表達與B

16、BB通透性和腦水腫的程度呈負(fù)相關(guān)。提示ICH后EBA在腦組織表達的減少、BBB通透性的開放均參與了腦水腫的形成。同時,BBB通透性與EBA的表達之間存在負(fù)性相關(guān),提示EBA的表達減少可能通過影響B(tài)BB的通透性間接參與了腦水腫的形成。本文關(guān)于EBA在ICH后腦水腫病理生理機制的探討結(jié)果,一方面完善ICH后腦水腫的發(fā)生和發(fā)展的可能機制,另一方面為臨床探索有效治療ICH的方法提供了一定的理論基礎(chǔ)。
　　 結(jié)論：
　　 1、本實