大鼠C6膠質瘤全顱放療后血腦屏障通透性改變與Claudin-5蛋白檢測.pdf

1、[研究目的]: 研究C6腦膠質瘤誘導的不同區(qū)域BBB通透性的改變，及不同劑量單次全腦放射線照射后早期大鼠BBB通透性的動態(tài)變化，從微血管超微結構特征和緊密連接蛋白Claudin-5探討B(tài)BB/BBTB通透性增高的主要途徑及其開放的變化情況，研究和探討放療與血腦屏障開放規(guī)律的關系，為指導腦膠質瘤放療提供動物實驗依據和可能的適時介入化療的劑量域及時間域。 [材料方法]: （1）采用立體定向方法在大鼠右側尾狀核接種10

2、μl含1×106膠質瘤細胞，建立大鼠C6膠質瘤模型20只。觀察大鼠的生存狀態(tài)、記錄生存時間，接種后第10、14、20天分別行MRI增強掃描。評價此方法膠質瘤模型成瘤率、瘤體大小變化情況、瘤生長持續(xù)時間，為后續(xù)研究提供穩(wěn)定的膠質瘤模型來源。 （2）空白組和荷瘤組大鼠各5只，荷瘤鼠于建模后第20天取腫瘤處、腫瘤臨近處（brain adjacent to tumor，BAT）即距腫瘤邊界2mm以內及腫瘤遠隔處（brain distan

3、t to tumor，BDT）即2mm以外的大腦半球腦皮質3個部位的腦組織和空白鼠右側尾狀核正常腦組織，采用外源性硝酸鑭透射電鏡示蹤法，觀察BBB/BBTB超微結構特征及硝酸鑭滲出情況，判定BBB破壞程度。 （3）空白組和荷瘤組（建模后20天）大鼠各5只，經免疫組化法測定緊密連接蛋白claudin-5在空白鼠和荷瘤鼠上述各部位的表達情況。 （4）荷瘤鼠（建模后17天）120只，隨機分為5組，即假照射組、5Gy、10Gy、

4、15Gy、20Gy組，行相應劑量全腦放射線單次照射。其中假照射組（來源于第一、二部分試驗），5Gy、10Gy和20Gy組各20只，于照射后1d處死8只，各4只分別行硝酸鑭透射電鏡示蹤法觀察BAT處BBB/BBTB通透性及免疫組化法測定緊密連接蛋白claudin-5的變化研究；15Gy組60只，分別于照射后1d、3d、7d、14d、21d、28d各處死8只進行上述相關指標的檢測；每組剩余12只至自然死亡。觀察并記錄各照射組大鼠的生存狀態(tài)、

5、生存時間。 [結果]: （1）SD大鼠右側尾狀核立體定向方法建立的C6腦膠質瘤模型確切可靠，成瘤率達97%以上，未見遠處及顱外轉移。荷瘤大鼠的早期癥狀包括運動減少，攻擊性減弱和精神萎靡等，晚期則有偏癱、眶周出血、癲癇和惡液質等表現(xiàn)，大鼠體重進行性減輕。MRI檢查見腫瘤呈圓形或類圓形，呈長T1低信號和長T2高信號，大多呈環(huán)狀強化。 （2）硝酸鑭示蹤電鏡觀察C6膠質瘤荷瘤鼠：腫瘤處可見La3+通過血管內皮細胞的緊密連

6、接及基底膜廣泛滲透至血管腔外及腦組織間隙內，部分毛細血管內皮細胞及神經細胞失去正常形態(tài)，結構破壞，大量La3+沉積在細胞核內、外；BAT處見La3+滲出至局部BM，大部分停滯在血管腔內，未見La3+滲透至血管外腦組織間隙內；BDT及對照組NBT處La3+分布在血管腔內，血管內皮細胞TJ結構完整，基底膜呈線狀連續(xù)，腦血管內皮細胞漿均未見La3+，血管腔外未見鑭顆粒沉積。統(tǒng)計學分析硝酸鑭滲出顯示：腫瘤處>BAT>BDT、NBT（P<0.05

7、），而BDT、NBT兩組結果無統(tǒng)計學差異。 （3）硝酸鑭示蹤電鏡觀察各不同劑量照射組荷瘤鼠BAT處BBB通透性：5Gy組荷瘤鼠BAT處見La3+滲出至局部基底膜，大部分分布在血管腔內，細胞形態(tài)結構未見明顯異常；10Gy組BAT處可見La3+滲出至廣泛基底膜，滲出量增加，緊密連接開放，細小的高電子密度鑭顆粒滲出至腦組織間隙，內皮細胞腫脹，部分滯留在血管腔內；15Gy、20Gy組BAT處均可見La3+滲出至基底膜、血管腔外、腦組織間

8、隙內及細胞內，內皮細胞腫大，腦組織水腫。統(tǒng)計學分析硝酸鑭滲出顯示：20Gy、15Gy>10Gy>5Gy、0Gy（P<0.05），而0Gy、5Gy兩組間及15Gy、20Gy兩組間結果無統(tǒng)計學差異。 （4）硝酸鑭示蹤電鏡觀察15Gy組照射后不同時間點荷瘤鼠BAT處BBB通透性變化：照射后第1、3天La3+滲出至基底膜、血管腔外、腦組織間隙內及細胞內，少許殘留在血管腔內；第7天為La3+滲出至基底膜，腦組織間隙內見細小的鑭顆粒，但細胞

9、內未見滲出，較前減弱；第14天為La3+滲出至局部基底膜，血管腔外、腦組織間隙內及細胞內均未見鑭顆粒沉積，大部分滯留在血管腔內；第21、28天均為La3+僅分布在血管腔內，未見滲出至基底膜、血管腔外及腦間質裂隙內。統(tǒng)計學分析硝酸鑭滲出顯示：1d、3d>7d>14d>21d、28d（P<0.05），而1d、3d兩組結果無統(tǒng)計學差異，21d、28d兩組結果完全相同。 （5）緊密連接蛋白claudin-5在空白鼠和荷瘤鼠腦組織中均沿血

10、管內皮細胞漿呈棕黃色或棕褐色陽性表達。對照組腦組織claudin-5的表達豐富、連續(xù)，呈中-強度表達，沿血管內皮細胞胞漿見棕黃色強染色；荷瘤組大鼠腫瘤處claudin-5表達減弱，呈輕度表達，沿血管呈間斷表達；BAT較對照組腦組織表達下降，呈中度表達，血管扭曲、變形，但仍呈連續(xù)狀態(tài)；BDT與對照組正常腦組織claudin-5表達相仿。統(tǒng)計學分析claudin-5表達顯示：腫瘤處>BAT>BDT、NBT（P<0.05），而BDT、NBT兩

11、組結果無統(tǒng)計學差異。 （6）緊密連接蛋白claudin-5在各不同劑量照射組荷瘤鼠BAT處的表達變化：5Gy組荷瘤鼠BAT處見較對照組腦組織表達下降，仍呈中度表達，血管扭曲、變形，但仍呈連續(xù)狀態(tài)；10Gy組BAT處可見較對照組腦組織表達下降，呈輕中度表達，血管扭曲、變形與間斷表達狀態(tài)并存；15Gy、20Gy組BAT處均可見較對照組腦組織表達下降，呈輕度表達，沿血管間斷表達，并見碎片狀。統(tǒng)計學分析：20Gy、15Gy>10Gy>5

12、Gy、0Gy（P<0.05），而0Gy、5Gy兩組間與15Gy、20Gy兩組間結果無統(tǒng)計學差異。 （7）緊密連接蛋白claudin-5在15Gy組照射后不同時間點荷瘤鼠BAT處的表達變化：照射后1d、3d緊密連接蛋白claudin-5呈輕度表達，沿血管間斷表達，并呈碎片狀表達；照射后第7d為輕中度表達，血管扭曲、變形與間斷表達狀態(tài)并存；照射后第14d為中度表達，血管扭曲、變形，但仍呈連續(xù)狀態(tài)：照射后第21d、28天為中強度表達，

13、出現(xiàn)部分小血管閉塞，出現(xiàn)連續(xù)與碎片表達并存。統(tǒng)計學分析：1d、3d>7d>14d>21d、28d（P<0.05），而1d、3d兩組間與21d、28d兩組間結果無統(tǒng)計學差異。 （8）C6膠質瘤腫瘤組織、BAT、NBT三個區(qū)域的硝酸鑭滲出與claudin-5表達兩者之間呈負相關，相關系數(shù)為rs=-0.599，P=0.04。腫瘤BAT處不同劑量放療1d后及15Gy照射后不同時間點的硝酸鑭滲出程度與claudin-5表達均呈顯著負相關，

14、相關系數(shù)分別為rs=-0.678，P=0.001和rs=-0.571，P=0.004。 （9）各組大鼠的生存時間：假照射組、5Gy組、10Gy組、15Gy組、20Gy組的MeST分別為24d、30.5d、37.5d、49d、63d，各組的MST分別為24.3±3.7d、33.0±7.4d、39.8±10.0d、65.3±47.1d、84.4±58.8d；四個照射組MeST的%ILS分別為27.1%、56.3%、104.2%、16

15、2.5%，各組MST的%ILS分別為35.8%、63.8%、168.7%、247.2%。四個照射組的生存期與假照射組比較均具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。 [結論]: （1）大鼠C6膠質瘤模型建立成功，接種后顱內腫瘤呈浸潤性生長，與人腦膠質瘤具有相似性。腦內接種1×106個C6細胞建立的模型用于治療實驗研究時，治療處理時間以細胞接種后第2～3周為宜。 （2）C6膠質瘤微血管超微結構改變是血腦屏障開放的結構基礎，緊

16、密連接開放是微血管通透性提高的主要原因。 （3）C6膠質瘤不同區(qū)域內皮超微結構改變與屏障功能破壞程度不一，距離腫瘤處越近，硝酸鑭滲出越明顯，claudin-5表達越低，細胞間TJ破壞越重，與微血管通透性增加呈正相關；在BDT處似正常腦組織，血腦屏障穩(wěn)定，硝酸鑭不滲出，claudin-5表達豐富，通透性最低；腫瘤的周邊存在不同程度的屏障，說明腫瘤存在周邊屏障。 （4）C6膠質瘤細胞的直接浸潤可以降低內皮細胞緊密連接蛋白cl

17、audin-5的表達，claudin-5從細胞處丟失是TJ開放的分子基礎，可能是誘導TJ破壞導致BBTB通透性增高的重要原因。 （5）受照大鼠BBB均出現(xiàn)病理改變，放療后大鼠claudin-5的表達進一步降低，說明放射線可致血腦屏障的緊密連接破壞增加，具有降低及破壞BBB功能的作用。 （6）C6膠質瘤腫瘤組織、BAT、NBT三個區(qū)域的硝酸鑭滲出與claudin-5表達兩者之間呈顯著負相關，荷瘤鼠不同劑量放療后1d及15G