雄黃對(duì)大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：采用大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察雄黃對(duì)體外培養(yǎng)的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，探討雄黃在體外引起腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的作用機(jī)制；建立C6裸鼠膠質(zhì)瘤皮下動(dòng)物模型，通過局部給藥的方法，觀察雄黃對(duì)體內(nèi)腫瘤的作用并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討。 方法： 1、C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)特性的觀察①培養(yǎng)條件：大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清、含100U/L青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于飽和濕度、37℃、5％CO2的孵箱中。

2、 ②C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)情況的觀察：倒置相差顯微鏡觀察C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)情況，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，消化后以1 x 105/孔接種于3個(gè)六孔板，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)2個(gè)復(fù)孔，在接種后2h、4h、6h、8h、10h、12h取出，計(jì)算傳代后的細(xì)胞在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的貼壁率變化(每孔計(jì)數(shù)3次，取均值)。 ③生長(zhǎng)曲線的繪制：采用MTT法測(cè)定細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上的生長(zhǎng)情況，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線：在24孔

3、細(xì)胞培養(yǎng)板上采用消化計(jì)數(shù)取多次平均值的方法測(cè)定細(xì)胞數(shù)目，繪制生長(zhǎng)曲線，計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間。 2、雄黃對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞系作用的體外實(shí)驗(yàn)①雄黃溶液的制備：按照參考文獻(xiàn)配制雄黃溶液，以原子吸收光譜法測(cè)定溶液中砷元素的含量以標(biāo)定藥物濃度。 ②雄黃溶液工作濃度的確定：以MTT法測(cè)定雄黃對(duì)C6細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，具體步驟如下。 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，加入雄黃溶液，調(diào)整最終反應(yīng)濃度分別為5mg/L、10mg/L、25mg/L、50mg

4、/L，和100mg/L；以PBS為陰性對(duì)照組，與試驗(yàn)孔平行設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照孔，分別作用24、48小時(shí)，上酶標(biāo)儀檢測(cè)，以空白對(duì)照孔調(diào)零，檢測(cè)570nm處的吸光度；以時(shí)間為橫軸，光吸收值(A570)為縱軸，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線;以陰性對(duì)照組的吸光度為參照，計(jì)算細(xì)胞存活率及IC50(半數(shù)抑制濃度)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，雄黃24小時(shí)和48小時(shí)的IC50均接近25mg/L，因此，我們選擇25mg/L作為雄黃的工作濃度。③超微結(jié)構(gòu)變化的觀察：取

5、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期C6細(xì)胞，常規(guī)消化傳代，24小時(shí)后加入雄黃溶液，調(diào)整濃度至25mg/L。分別作用于C6細(xì)胞24小時(shí)和48小時(shí)后，收集細(xì)胞，經(jīng)戊二醛固定后制作透射電鏡標(biāo)本，在電鏡下觀察雄黃引起的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。 ④早期凋亡的觀察：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，傳代培養(yǎng)24小時(shí)后，加入雄黃溶液調(diào)整濃度至25mg/L，分別作用24和48小時(shí)后，以Annexin V-FITC-PI雙染法標(biāo)記C6細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀觀察其早期凋亡情況。 ⑤中晚期凋

6、亡的觀察：制備細(xì)胞爬片，以雄黃溶液分別作用于C6細(xì)胞24和48小時(shí)后，用TUNEL法標(biāo)記DNA斷端，觀察雄黃引起的中晚期凋亡，在光鏡下計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)。 ⑥Bax，Bcl-2和c-myc mRNA的表達(dá)：雄黃溶液作用C6細(xì)胞24和48小時(shí)后，收集細(xì)胞，常規(guī)提取總mRNA，以RT-PCR法檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Bax，Bcl-2和癌基因c-myc mRNA的表達(dá)情況。 ⑦Bax，Bcl-2和c-myc蛋白的表達(dá)：雄

7、黃溶液作用于C6細(xì)胞24和48小時(shí)，常規(guī)提取總蛋白，以免疫印跡法(Western Blotting)檢測(cè)Bax，Bcl-2和c-myc蛋白的表達(dá)情況。 ⑧細(xì)胞增殖活性檢測(cè)：制備細(xì)胞爬片，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對(duì)雄黃溶液作用24和48小時(shí)后的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行PCNA標(biāo)記，觀察細(xì)胞的增殖活性變化。 3、雄黃抗C6膠質(zhì)瘤的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)①動(dòng)物模型的建立和觀察：抽取含105個(gè)C6單細(xì)胞懸液接種于裸鼠臀部皮下，建立C6/Balb/c裸小

8、鼠皮下膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型，每天測(cè)量腫瘤直徑，觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況，待腫瘤直徑達(dá)5mm時(shí)分組進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。 ②藥物干預(yù)：裸鼠隨機(jī)分為無干預(yù)組、PBS陰性對(duì)照組和雄黃治療組。建模成功后，無干預(yù)組正常飼養(yǎng)，不予其他任何處理；PBS對(duì)照組和雄黃治療組采用局部注射的方法，分別將PBS和雄黃一次性注入動(dòng)物瘤體內(nèi)，觀察記錄腫瘤生長(zhǎng)情況，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。治療后第11天處死動(dòng)物，取腫瘤組織行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。③腫瘤組織的鑒定：使用免疫組化法對(duì)所得組織進(jìn)行GFA

9、P染色，檢測(cè)GFAP表達(dá)情況，確定其腫瘤膠質(zhì)細(xì)胞來源。 ④形態(tài)學(xué)觀察：通過HE染色觀察腫瘤組織的顯微結(jié)構(gòu)變化，電鏡下觀察實(shí)驗(yàn)各組的腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。 ⑤用TUNEL，法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況：對(duì)照組和雄黃處理組腫瘤組織的石蠟切片經(jīng)常規(guī)處理后按照TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行標(biāo)記、染色，光鏡下計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，計(jì)算凋亡指數(shù)。 ⑥腫瘤組織的Bcl-2、Bax和c-myc mRNA和蛋白表達(dá)情況的觀察：分別使用RT-PCR法和W

10、estern Blotting法檢測(cè)PBS組和雄黃治療組腫瘤組織Bcl-2、Bax和c-myc mRNA和蛋白表達(dá)情況。 4、統(tǒng)計(jì)分析： 使用SPSS for Windows 11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有計(jì)量資料均以“x±s”的形式表示，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的情況(樣本數(shù)量、方差齊性、正態(tài)性檢驗(yàn))選擇適當(dāng)?shù)臋z驗(yàn)方法(t檢驗(yàn)、方差分析或非參數(shù)檢驗(yàn))；計(jì)數(shù)資料的比較采用率的比較。 結(jié)果： 1、C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)特性觀

11、察： ①我們所獲得C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞具備生長(zhǎng)穩(wěn)定的特點(diǎn)，在一定培養(yǎng)階段能夠呈對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)。倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈梭形或三角形，大小均勻，排列緊密，折光性強(qiáng)，細(xì)胞膜光滑無突起，細(xì)胞核呈圓形，居中，核仁不明顯，細(xì)胞增殖活躍，核分裂相多見。2h、4h、6h、8h、10h、12h時(shí)的貼壁率分別為22％，70％，85％，87％，92％，97％，符合實(shí)驗(yàn)要求。 ②以MTT法測(cè)定的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，顯示按照4×103/孔的濃度種

12、植于96孔板、2×104/孔種植于24孔板均可獲得自接種24小時(shí)后開始連續(xù)3天的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，可以滿足實(shí)驗(yàn)的要求。 2、雄黃抗C6膠質(zhì)瘤的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果①所配制的雄黃原溶液經(jīng)原子吸收光譜法測(cè)定砷濃度為1034mg/L。 ②按MTT結(jié)果顯示，各濃度的雄黃作用于C6細(xì)胞24、48小時(shí)后的抑制率與陰性對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)：作用24小時(shí)，臨近濃度組間(5mg/L與10mg/L組間，10mg/L、25mg/L和50

13、mg/L組間)的抑制率經(jīng)組內(nèi)兩兩比較比較沒有發(fā)現(xiàn)顯著性差異。而在48小時(shí)時(shí)，各濃度之間的抑制率差別增加，相鄰濃度組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。100mg/L組與其他各濃度組均有顯著性差異(P＜0.05)。曲線作圖后根據(jù)公式計(jì)算得24小時(shí)和48小時(shí)的IC50分別為28mg/L、26mg/L，(圖1-7)。 ③電鏡下觀察到發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組細(xì)胞呈橢圓形，表面微絨毛正常，染色質(zhì)在胞核內(nèi)分布均勻，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生活躍；在雄黃作用24小時(shí)組可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡

14、變化，如核固縮、染色質(zhì)趨邊凝聚等；作用48小時(shí)可發(fā)現(xiàn)除上述改變外，少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)壞死改變。 ④Annexin V-FITC-PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，雄黃作用于C6細(xì)胞可發(fā)現(xiàn)凋亡特征，24小時(shí)和48小時(shí)的凋亡率分別為10.13±3.14％和41.04±17.44％，二者比較有顯著性差異。 ⑤TUNEL結(jié)果顯示，雄黃作用24、48小時(shí)細(xì)胞的陽性率分別為8.7±1.83％和12.2±5.75％，二者比較有顯著性差異。

15、 ⑥RT-PCR結(jié)果：與對(duì)照組比較，雄黃溶液作用24小時(shí)后，c-mvc和Bcl-2 mRNA表達(dá)受抑，Bax mRNA的表達(dá)水平升高，在作用48小時(shí)更明顯，以上結(jié)果均有顯著性差異(P＜0.05)。 ⑦Western Blotting結(jié)果：與對(duì)照組相比，雄黃作用于C6細(xì)胞24小時(shí)能使Bcl-2和c-myc蛋白表達(dá)降低，并促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)水平，其作用在48小時(shí)更加明顯(P＜0.05)。 ⑧PCNA免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)25m

16、g/L的雄黃作用24和48小時(shí)的PCNA指數(shù)分別為76.6±11.2％和81.2±12.1％，與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 3、雄黃抗C6膠質(zhì)瘤的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 4、結(jié)論 ①本實(shí)驗(yàn)表明，雄黃對(duì)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞有抑制作用，且具有濃度和時(shí)間依賴性。雄黃均可在體內(nèi)外引起C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，其機(jī)制與細(xì)胞增殖活性無關(guān)。 ②初步的形態(tài)學(xué)觀察和凋亡檢測(cè)表明雄黃引起的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制可能與細(xì)胞凋亡有關(guān)；雄黃誘導(dǎo)C6細(xì)胞凋