電離輻射對(duì)膠質(zhì)瘤c6細(xì)胞垂體瘤轉(zhuǎn)化基因表達(dá)的影響

1、<p>　　電離輻射對(duì)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞垂體瘤轉(zhuǎn)化基因表達(dá)的影響</p><p>　　作者：姜平 戴如飛 蔡軍 劉寧 駱慧 閆志海 閻超 </p><p>　　【摘要】 目的 探討電離輻射對(duì)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞垂體瘤轉(zhuǎn)化基因（pituitary tumor transforming gene， PTTG）表達(dá)的影響。方法 膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞分為4組（n=6）：A組（空白對(duì)照組）、B組（2 G

2、y劑量X射線組）、C組（4 Gy劑量X射線組）、D 組（6 Gy劑量X射線組），X射線照射后12 h，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)PTTG mRNA的表達(dá),免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)其蛋白表達(dá)。結(jié)果 PTTG mRNA在X射線處理組均降低，隨著X射線劑量的增加，其表達(dá)降低越明顯，A、B、C、D 4組的表達(dá)分別為 1.910±0.141、 1.398±0.157、1.010±0.133、0.743±

3、0.092，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P&lt; 0.01)。PTTG蛋白積分光密度 (integrated optical density，IOD) 在X射線處理組均降低，隨著X射線劑量的增加，其表達(dá)降低越明顯，A、B、C、D 4組的IOD分別為1.840±0.089、1.395±0.139、0.893±0.125、 0.597±0.104，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P</p>

4、;<p>　　【關(guān)鍵詞】 膠質(zhì)瘤；電離輻射；垂體瘤轉(zhuǎn)化基因 </p><p>　　Abstract: Objective To investigate the effect of ionizing radiation on the expression of pituitary tumor transforming gene (PTTG) in glioma C6 cells. Methods

5、 Glioma C6 cells were divided into 4 groups (n=6): group A (control group), group B (2 Gy doses of X-ray group), group C (4 Gy doses of X-ray group), group D (6 Gy doses of X-ray group). The expression of PTTG mRNA was d

6、etected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) 12 hours after X-ray irradiation and the expression o</p><p>　　Key words: glioma; ionizing radiation; pituitary tumor transforming gene <

7、;/p><p>　　很多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)X射線可以影響眾多參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的基因的表達(dá)，通過(guò)基因改變對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的調(diào)控而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡。垂體瘤轉(zhuǎn)化基因（pituitary tumor transforming gene， PTTG）是一種促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的基因，而電離輻射對(duì)該基因有何影響，國(guó)內(nèi)外均鮮見報(bào)道。本研究應(yīng)用不同劑量的X射線作用于膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)PTTG m

8、RNA的表達(dá),免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)其蛋白表達(dá),探討電離輻射對(duì)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞垂體瘤轉(zhuǎn)化基因表達(dá)的影響，為探討放療對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制提供新的理論依據(jù)。 </p><p><b>　　1 材料和方法 </b></p><p>　　1.1 材料 膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海分院），DNTP、Taq DNA聚合酶（dT）、Oligo15、 AVM逆轉(zhuǎn)錄酶(Pro

9、mega公司)，鼠抗人PTTG單克隆抗體 (Santa Cruz公司)，鏈親合素卵白素-過(guò)氧化物酶(streptavidin-peroxidase, SP) 、DAB試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)。 </p><p>　　1．2 細(xì)胞培養(yǎng)、X射線處理及分組 膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞在含有 10%新生小牛血清、青霉素1×105 U/L、鏈霉素1×105 U/L DMEM培養(yǎng)基中，5% CO2、37

10、℃條件下培養(yǎng)。分為A、B、C、D 4組（n=6）。A組（空白對(duì)照組）不進(jìn)行X射線照射處理；對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞采用醫(yī)用直線加速器的6 MV X射線照射，按照射劑量分為2 Gy （B組）、4 Gy（C組）、6 Gy（D組） 3個(gè)劑量組，照射野為10 cm×10 cm,等中心照射，照射完畢常規(guī)培養(yǎng)12 h后進(jìn)行檢測(cè)。 </p><p>　　1．3 RT-PCR 檢測(cè)PTTG mRNA的表達(dá) Trizol提取

11、總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度。RT-PCR 檢測(cè)PTTG mRNA的表達(dá)，以β2-微球蛋白（β2-M）為內(nèi)參照，設(shè)計(jì)PTTG、β2-M引物序列如下（上海生物工程公司合成）：PTTG引物上游5′-CTAAGGATGGGCTGAAGCTG-3′,下游5′-CAAACAGGTGGCAATTC-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度496 bp；β2-M引物上游5′-GTAAGCAGCATCATGCA-3′，下游5′-TGGAGGAACCTGGTCA-3

12、′，擴(kuò)增長(zhǎng)度300 bp。合成cDNA的第一鏈反應(yīng)體系為25 μl，包括Oligo15 0.5 μg, AVM逆轉(zhuǎn)錄酶10 U。以cDNA為模板的PCR反應(yīng)體系包括：逆轉(zhuǎn)錄混合液4 μl，Taq DNA聚合酶0.8 μl，兩種引物(50 μmol/L)各1 μl。PCR循環(huán)條件：變性95℃ 5 min，94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，延伸72℃10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳，將凝膠在圖像分析系統(tǒng)

13、分析，計(jì)算PTTG的光密度值，以β2-M的光密度</p><p>　　1.4 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)PTTG蛋白表達(dá) 制備細(xì)胞片，采用SP法檢測(cè)PTTG蛋白表達(dá)，以腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)黃色或棕黃色著色或顆粒為PTTG蛋白陽(yáng)性表達(dá)：陽(yáng)性染色細(xì)胞條件為細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、陽(yáng)性顆粒定位好、著色與背景對(duì)比清晰。應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，每張切片隨機(jī)選取3個(gè)高倍視野（×200），分別測(cè)得3個(gè)視野積分光密度(integrat

14、ed optical density，IOD)值后取平均值。 </p><p>　　1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 10.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用單因素方差分析總體有差異后，LSD進(jìn)一步兩兩比較各組間差異。P&lt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 </p><p><b>　　2 結(jié) 果 </b></p

15、><p>　　2.1 不同劑量X射線對(duì)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞PTTG mRNA表達(dá)的影響 RT-PCR 檢測(cè)PTTG mRNA的表達(dá)顯示有496 bp片斷的PTTG mRNA特異擴(kuò)增條帶（圖1）。與A組比較，不同劑量的X射線均可降低PTTG mRNA的表達(dá)，其降低水平隨著X射線劑量的增加而增加，單因素方差分析表明4組總體間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），LSD進(jìn)一步兩兩比較各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表

16、1。 </p><p>　　2.2 不同劑量X射線對(duì)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞PTTG蛋白表達(dá)的影響 PTTG蛋白陽(yáng)性表達(dá)顯示主要定位于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)，彌漫性全細(xì)胞分布，少量定位于細(xì)胞核（圖2）。與A組比較，不同劑量的X射線均可降低PTTG蛋白的表達(dá)，其降低水平隨著X射線劑量的增加而增加。單因素方差分析表明4組總體間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），LSD進(jìn)一步兩兩比較顯示各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1

17、。表1 不同劑量X射線處理后PTTG mRNA及蛋白的表達(dá)情況 </p><p><b>　　3 討 論 </b></p><p>　　關(guān)于電離輻射對(duì)基因表達(dá)的影響國(guó)內(nèi)外均有較多的報(bào)道。各種不同基因的表達(dá)對(duì)電離輻射的反應(yīng)不同。鞠桂芝等［1］發(fā)現(xiàn)電離輻射可顯著促進(jìn)昆明小鼠胸腺p16 mRNA及其蛋白的表達(dá)。Hamasu等［2］報(bào)道,5 Gy X射線照射可誘導(dǎo)MKN

18、45及MKN28胃癌細(xì)胞凋亡,同時(shí)caspase表達(dá)明顯增高。李平法等［3］報(bào)道5 Gy γ射線能顯著誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞hR24L基因的表達(dá)。盛方軍等［4］證實(shí)電離輻射后AT細(xì)胞hTERT mRNA表達(dá)水平上升，閆風(fēng)琴等［5］發(fā)現(xiàn)電離輻射可以上調(diào)小鼠EL-4淋巴瘤細(xì)胞P21蛋白表達(dá)水平，Samuni等［6］證實(shí)電離輻射能增強(qiáng)人淋巴母細(xì)胞瘤中p53的表達(dá)。劉光偉等［7］的研究結(jié)果表明電離輻射可以誘導(dǎo)生精細(xì)胞P53蛋白表達(dá)增加的同時(shí)凋亡抑制基

19、因Bcl-2蛋白表達(dá)下降。 </p><p>　　PTTG是Pei于1997年首次從大鼠垂體腺瘤GH4細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的基因，該基因含5個(gè)外顯子、4個(gè)內(nèi)含子，編碼199個(gè)氨基酸組成的相對(duì)分子質(zhì)量為25 000的蛋白。PTTG在眾多腫瘤中對(duì)加速細(xì)胞分化、加快腫瘤血管生成、促進(jìn)腫瘤形成起到重要的作用。PTTG作為促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的基因與腫瘤細(xì)胞周期的調(diào)控有密切的關(guān)系。關(guān)于電離輻射對(duì)PTTG的影響國(guó)內(nèi)外鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)

20、運(yùn)用不同劑量的X射線作用于膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞，結(jié)果顯示電離輻射可降低PTTG mRNA及其蛋白表達(dá)水平，并且呈一定的劑量依賴性，即隨著X射線劑量的增高，其表達(dá)水平下降更明顯。 </p><p>　　細(xì)胞的輻射敏感性隨著細(xì)胞周期時(shí)相而改變，在G1期有一定的抵抗性，隨著向S期移行敏感性降低，在G1/S邊界上敏感性上升，進(jìn)入S期后下降，在S期末達(dá)到最高。進(jìn)入G2和M期，細(xì)胞敏感性上升，即細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性按M期、G2期、G

21、1期、早S期、晚S期依次遞減。有研究表明，正常情況下PTTG的表達(dá)與腫瘤的細(xì)胞周期有明顯的相關(guān)性。Ramos-Morales等［8］將培養(yǎng)在10%清中的HeLa細(xì)胞或Cos細(xì)胞轉(zhuǎn)移至0.15%血清中3天以造成細(xì)胞缺乏營(yíng)養(yǎng),細(xì)胞有絲分裂減少,然后檢測(cè)兩種標(biāo)本中PTTG的表達(dá),發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞有絲分裂時(shí)PTTG mRNA的表達(dá)明顯增高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PTTG在細(xì)胞有絲分裂的G1/S交界期最低,Ｓ期升高；在G2/M交界期最高,G1期又開始降低。同時(shí)

22、研究證實(shí),在細(xì)胞有絲分裂時(shí)PTTG蛋白上的Ser165位點(diǎn)被Cdc2磷酸化。當(dāng)Ser165被Ala替代時(shí)或受到Cdc2抗體的干擾時(shí),則PTTG的磷酸化水平下降。這說(shuō)明PTTG的表達(dá)呈細(xì)胞周期依賴性。我們認(rèn)為電離輻射對(duì)PTTG的影響可能是通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期的影響實(shí)現(xiàn)的。 </p><p>　　本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了電離輻射能降低PTTG的表達(dá)水平，但同一劑量的放射線在不同時(shí)間對(duì)PTTG表達(dá)的影響如何，該基因?qū)﹄婋x輻射的損傷是

23、否有自我修復(fù)功能將是我們下一步研究的內(nèi)容。 </p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】 </b></p><p>　?。?］ 鞠桂芝，王小梅，付士波，等.電離輻射對(duì)p16基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)的的影響［J］ .中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志，2003，23（1）：4-6. </p><p>　?。?］ Hamasu T, Inanami O, Asanum

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