IL-18基因對C6膠質瘤細胞MDR1基因表達的影響.pdf

1、神經(jīng)膠質瘤是人類最常見的腦部腫瘤。目前,惡性膠質瘤的常規(guī)治療手段(手術加放化療)治療困難、遠期效果差,死亡率高。對于惡性程度高的膠質瘤患者,生存期短、5年生存率小于1％。怎樣改善膠質瘤的治療效果,是臨床面對的一個難題。近年來,隨著分子生物學、分子遺傳學的研究進展,對于腫瘤的基因治療方面取得了長足進步,為提高惡性膠質瘤的治療效果,增加患者的生存率開拓了新的思路。
　　 白細胞介素18(interleukin-18,IL-18)是一

2、個具有多種生物學活性的細胞因子。可激活T細胞、NK細胞,促使其產(chǎn)生INF-γ。研究證實,在T細胞或NK細胞存在的情況下,IL-18具有明顯的抗腫瘤作用,而消除T細胞、NK細胞或INF-γ作用后,IL-18仍可誘導腫瘤細胞凋亡。研究表明,外源性IL-18基因能下調(diào)PCNA、cyclin D1、cyclin B1的表達,上調(diào)p21的表達,從而降低C6細胞的增殖能力和惡性程度。
　　 MDR1基因表達產(chǎn)物P-糖蛋白(P-glycopr

3、otein,P-gp),是細胞膜上的跨膜蛋白,可在膜上形成藥物通道,具有藥泵功能,參與藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄過程,與腫瘤對化療藥物的敏感性密切相關。此外,P-gp可能具有抑制細胞死亡的作用。因此,P-gp的表達水平是影響病人術后化療效果及生存時間的主要因素之一。本實驗主要研究MDR1基因在C6/IL-18細胞系中的表達,并探討其對化療藥物順鉑敏感性的影響。
　　 目的:研究IL-18基因對大鼠C6膠質瘤細胞MDR1基

4、因表達影響。
　　 方法:
　　 1.細胞培養(yǎng):C6和C6/IL-18細胞,用RPMI1640培養(yǎng)基,內(nèi)含10％胎牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100μg/ml。37℃、飽和濕度、5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)。
　　 2.MTT法檢測C6和C6/IL-18細胞對順鉑的敏感性:取對數(shù)生長期C6和C6/IL-18細胞,經(jīng)0.04％EDTA消化后,加入培養(yǎng)液吹打混勻,以1.5×105/ml細胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板,每孔

5、加入180μl細胞懸液。24h后按照實驗分組分別加入經(jīng)生理鹽水稀釋的不同濃度的藥物20μl,每組均做3個復孔。藥物與細胞共同培養(yǎng)24h,每孔加入5mg/ml MTT20μl,繼續(xù)孵育4小時后,離心棄上清,加入150μl/孔DMSO終止反應,振蕩儀振蕩10 min。用酶標儀在490nm波長下測吸光值(A值)。計算細胞抑制率和順鉑對兩種細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。本實驗重復3次。
　　 3.流式細胞術檢測細胞凋亡:取對數(shù)生長期C

6、6細胞和C6/IL-18細胞,加入IC50的CDDP作用24h后,0.04％EDTA消化、離心,用冷PBS洗兩次,70％乙醇固定細胞24 h。上機前離心去乙醇,用PBS洗兩次,加100μg/ml
　　 RNnase37℃消化30 min。50μg/ml PI染色30 min。經(jīng)尼龍網(wǎng)過濾后,用FACSTAR Calibur型流式細胞儀(Becton Dickinson,CA,USA)測定。同時用不加藥的相應細胞為對照組。實驗重復

7、3次。
　　 4.用RT-PCR法檢測MDR1基因mRNA的表達情況,以β—actin為內(nèi)參；檢測兩種細胞IL-18 mRNA的表達情況,作為旁證。根據(jù)核苷酸序列用Premier5.0軟件設計MDR1和β-actin引物。然后,采用Trizol法提取C6和C6/IL-18細胞總RNA,取2μg細胞總RNA逆轉錄成cDNA(37℃60 min,95℃5min),取2μl逆轉錄產(chǎn)物進行PCR擴增。條件為95℃預變性10 min,95

8、℃變性40 s,51℃退火40 s,72℃延伸40 s,共30個循環(huán),72℃再延伸10 min,4℃保存。最后,PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳觀察結果、照相,用凝膠。蛋白圖像分析系統(tǒng)分析結果,分別計算C6和C6/IL-18細胞條帶的積分光密度與相對的β-actin條帶積分光密度的比值。實驗重3次。
　　 5.采用Western-Blot法檢測P-gp表達情況,以β-actin為內(nèi)參。用質膜蛋白抽提試劑盒,提取C6、C6/IL

9、-18細胞的胞漿蛋白和膜蛋白,用考馬斯亮藍G250試劑盒檢測抽提的蛋白濃度。每孔加入100μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳,將靶蛋白從凝膠轉移至硝酸纖維素(NC)膜。NC膜在5％脫脂奶粉中封閉1 h,加入小鼠一抗4℃過夜,然后與辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠二抗37℃溫育1 h,利用化學發(fā)光法進行顯色反應,照相并用凝膠-蛋白圖像分析系統(tǒng)測定各蛋白條帶的積分光密度值,分別計算C6和C6/IL-18細胞條帶與相對的β—actin條帶積分光

10、密度比值。實驗重復3次。
　　 6.實驗數(shù)據(jù)以(x)±s表示,用SPSS13.0統(tǒng)計軟件作單因素方差分析(One-Way ANOVA),取P<0.05為有顯著性意義。
　　 結果:
　　 1.順鉑作用24h后,C6細胞160、80、40、20、10、5、2.5、0.5μg/ml順鉑組的細胞抑制率是54.26±3.08％、52.92±4.18％、49.20±4.34％、41.40±5.19％、32.35±5.34％

11、、20.69±5.40％、14.27±4.77％、9.20±5.32％；C6/IL-18細胞的相應抑制率分別是69.86±3.82％、65.27±3.72％、60.94±3.37％、53.94±4.81％、40.37±4.72％、29.93±4.68％、20.85±5.08％、8.27±4.61％。C6/IL-18細胞對順鉑的敏感性增加,與C6細胞同組的細胞抑制率比較有顯著性差異(P<0.05),C6細胞和C6/IL-18細胞順鉑的IC

12、50分別為55.49±11.04μg/ml和29.66±6.34μg/ml,經(jīng)比較具有顯著性差異(P<0.05)。
　　 2.流式細胞術檢測細胞凋亡,數(shù)據(jù)顯示C6和C6/IL-18細胞的凋亡率分別為2.40±1.43％和8.72±2.16％,在加入IC50順鉑作用后其凋亡率分別10.57±1.93％和22.63±2.85％。數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學分析,差異顯著(P<0.05)。表明,IL-18基因本身能引起細胞凋亡；在加入藥物后導致細胞凋

13、亡進一步增加,提示IL-18基因能夠提高膠質瘤細胞對順鉑的敏感性。
　　 3.RT-PCR結果顯示IL-18 mRNA在C6細胞中無表達,而在C6/IL-18細胞中表達明顯。C6和C6/IL-18細胞MDR1 mRNA的光密度比值分別為0.54±0.06和0.11±0.01,經(jīng)統(tǒng)計軟件做單因素方差分析,C6/IL-18細胞MDR1 mRNA表達水平較C6細胞差異明顯,具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明,IL-18基因能顯著降低

14、細胞MDR1基因的轉錄水平。
　　 4.對Western-blot結果進行測量,C6和C6/IL-18細胞P-糖蛋白的光密度比值分別為0.40±0.04和0.09±0.02,做單因素方差分析,結果顯示C6/IL-18細胞P—gp表達水平較C6細胞差異明顯,具有統(tǒng)計學意義(<0.05)。說明,IL-18基因能顯著降低細胞P-gp的表達水平。
　　 結論:IL-18基因與順鉑結合可明顯增加對膠質瘤細胞的抑制作用。其作用機理與