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文檔簡介
1、目的: 本文利用免疫細(xì)胞化學(xué)和western-blot方法觀察緩激肽作用下,大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子CREB磷酸化的動(dòng)態(tài)變化;并利用RT-PCR技術(shù)和放射免疫法觀察緩激肽作用大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)液中IL-1p、IL-6的表達(dá)變化,及利用RNA干擾(RNA imerference,RNAi)技術(shù)探討CREB的磷酸化是否介導(dǎo)了緩激肽刺激大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)IL-1β的表達(dá)。 材料和方法: 一、實(shí)驗(yàn)材
2、料 1、細(xì)胞 大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株由中國醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。 2、主要試劑 DMEM、胰蛋白酶購自Gibco公司;胎牛血清購白天津H&Y生物公司;緩激肽購自Sigma公司;Lipofectamine2000購自Invitrogen公司;兔抗鼠CREB及磷酸化CREB多克隆抗體購自Cell Signaling公司;SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色劑均購自武漢博士德公司;羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記
3、的IgG二抗購自北京中山生物技術(shù)公司;RNAout,IL-1β、IL-6引物,RT-PCR試劑均購自大連寶生物工程有限公司;siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成;IL-1β、IL-6測定試劑盒購自北京東亞免疫技術(shù)研究所。 3、主要儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱;倒置顯微鏡;臺式低溫超速離心機(jī);超聲粉碎機(jī)電泳儀;轉(zhuǎn)印儀;PCR擴(kuò)增儀;凝膠自動(dòng)成像儀。 二、實(shí)驗(yàn)方法 1、細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)于含10
4、%的滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,置5%的CO<,2>、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),1d更換培養(yǎng)基1次,2~3d傳代1次。 2、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測緩激肽作用下CREB蛋白的磷酸化取對數(shù)生長期的大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞,經(jīng)0.25%的胰酶消化后,制成單細(xì)胞懸液,以10<'9>L的濃度接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中,置5%的CO<,2>、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng),待細(xì)胞生長近單層后,加入1μmol/L緩激肽(終濃度)。分別孵育0、5
5、、10、15、20、30min,棄去培養(yǎng)液,對不同作用時(shí)相所得標(biāo)本進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。經(jīng)Motic數(shù)碼攝像系統(tǒng)采集照片,以Motic images advanced 3.O圖象處理軟件進(jìn)行分析。每張切片隨機(jī)選取400倍物鏡下3個(gè)視野,計(jì)算平均光密度值表示CREB蛋白磷酸化程度。對照組未經(jīng)緩激肽處理,PBS代替一抗作為陰性對照。 3、Western-blot檢測緩激肽作用下CREB蛋白的磷酸化接種10<'9>/L濃度的大鼠C6膠
6、質(zhì)瘤細(xì)胞于100ml的培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)至對數(shù)生長期后,加入緩激肽終濃度至1μmol/L,,分別孵育0、5、10、15、20、30min后,棄去培養(yǎng)液。以PBS液洗后,4℃1000r/min離心10min收集細(xì)胞,然后進(jìn)行western-blot檢測。所得X光膠片用Chemi Imager 5500 V2.0軟件掃描,通過Fluor Chen 2.0軟件進(jìn)行定量分析,測得整合光密度值(integrated density value,IDV
7、)。 4、RT-PCR檢測緩激肽作用下IL-1β mRNA、IL-6 mRNA的表達(dá)PCR引物的設(shè)計(jì)。 5、放射免疫法測定C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)IL-1β、IL-6的含量收集1μmol/L緩激肽分別作用細(xì)胞0~60min的培養(yǎng)上清液,由專業(yè)人員按說明書操作,自動(dòng)打印結(jié)果。 6、siRNA轉(zhuǎn)染及鑒定siRNA設(shè)計(jì)及合成。 7、RT-PCR檢測CREB特異性siRNA轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞后,緩激肽作用下IL-1β m
8、RNA的表達(dá)細(xì)胞轉(zhuǎn)染CREB特異性siRNA(80riM)72h后,分別用1μmaol/L終濃度的緩激肽作用C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞0、5、10、15、30、60min,并設(shè)立轉(zhuǎn)染前空白對照。然后用RNAout試劑提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色,然后用Bio-Rad凝膠成像儀成像,并用Fluor ChenV2.0 Stand Alone軟件對圖象進(jìn)行分析,以GAPDH為內(nèi)參照,結(jié)果
9、以IL-1β/GAPDH的IDV比值表示。 8、放射免疫法檢測JJCREB特異性siRNA轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞后,緩激肽作用下培養(yǎng)液中IL-1β的表達(dá)細(xì)胞轉(zhuǎn)染CREB特異性siRNA(80nM)72h后,分別收集緩激肽作用C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞0、5、10、15、30、60min的細(xì)胞培養(yǎng)上清液,并設(shè)立轉(zhuǎn)染前對照。由專業(yè)人員按說明書操作。 9、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理所有數(shù)值以x±s表示,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)分析,P<
10、0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論: 1、緩激肽可促進(jìn)大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子CREB的磷酸化,此作用可能與其促進(jìn)血腫瘤屏障的選擇性開放有關(guān)。 2、緩激肽可刺激大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中IL-1β的分泌增強(qiáng),IL-1β的表達(dá)上調(diào)可能在緩激肽增加血腫瘤屏障通透性的過程中發(fā)揮一定作用。 3、緩激肽作用C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞60min以內(nèi)未引起IL-6的表達(dá)增強(qiáng),這為緩激肽臨床應(yīng)用的安全性提供了有利的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
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