粘液放線菌菌毛對成纖維細(xì)胞表達IL-1β，IL-6，TNF-α的影響.pdf

1、粘液放線菌(Actinomyces viscosus)是導(dǎo)致牙周病患者牙周組織破壞的主要致病菌。研究表明，粘液放線菌菌毛促進了粘液放線菌與牙周組織的粘附，是引起牙周病病理變化的重要細(xì)胞結(jié)構(gòu)。但是粘液放線菌菌毛的免疫學(xué)作用卻未見報道。因此，探討粘液放線菌菌毛對于某些與免疫有關(guān)的細(xì)胞因子的影響，對于闡明粘液放線菌在牙周病發(fā)病機理中所起的作用具有重要的理論意義。 目的：提取粘液放線菌菌毛，并檢測這種促進粘液放線菌和牙周組織的粘附的細(xì)胞

2、結(jié)構(gòu)是否能引起成纖維細(xì)胞表達釋放IL-1β，IL-6，TNF-α。 方法：首先用漩渦混勻器攪拌粘液放線菌懸液，然后采用低溫高速離心分離，提取粘液放線菌菌毛。采用考馬斯亮藍法和葸酮法測定菌毛中蛋白質(zhì)和糖的含量，并進行氨基酸組成分析，結(jié)合電鏡觀察，以確定菌毛的純度。將提取的粘液放線菌菌毛與小鼠成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，48h后收集細(xì)胞培養(yǎng)基，用Western-blotting的方法分別檢測細(xì)胞培養(yǎng)基中IL-1α， IL-6，TNF-α的表達

3、水平。 結(jié)果： 1．電鏡結(jié)果： (1)厭氧培養(yǎng)48h后，粘液放線菌菌株19246表面存在菌毛。 (2)漩渦混勻器攪拌，結(jié)合低溫高速離心處理后，粘液放線菌菌毛與菌體充分分離，得到菌毛粗提物。 2．菌毛的化學(xué)組成： 粘液放線菌菌毛主要由大量的蛋白質(zhì)和少量的糖組成，粘液放線菌菌毛包含大量的谷氨酸，甘氨酸，精氨酸；非極性氨基酸百分含量最高。 3．Western blotting結(jié)果：

4、 (1)將SDS-PAGE凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用山羊抗小鼠TNF-a單克隆抗體及堿性磷酸酶標(biāo)記兔抗山羊IgG多克隆抗體二抗進行檢測。結(jié)果表明，菌毛處理過的細(xì)胞培養(yǎng)基中可檢測到TNF-a，而未經(jīng)菌毛處理的細(xì)胞培養(yǎng)基中未見TNF-a。 (2)將SDS-PAGE凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，兔抗小鼠IL-1β單克隆抗體及堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG多克隆抗體二抗進行檢測。結(jié)果表明，菌毛處理過的細(xì)胞培養(yǎng)基中可檢測到IL-

5、1β，而未經(jīng)菌毛處理的細(xì)胞培養(yǎng)基中未見IL-1β。 (3)將SDS-PAGE凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用山羊抗小鼠IL-6多克隆抗體及堿性磷酸酶標(biāo)記兔抗山羊IgG多克隆抗體二抗進行檢測。結(jié)果表明，菌毛處理過的細(xì)胞培養(yǎng)基中可檢測到IL-6，而未經(jīng)菌毛處理的細(xì)胞培養(yǎng)基中未見IL-6。 結(jié)論： 1、建立漩渦混勻器結(jié)合低溫高速離心的新方法充分分離粘液放線菌菌體和菌毛，得到菌毛粗提物。 2、粘液放線菌菌毛