shRNA抑制MDR1的表達(dá)對(duì)人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞多藥耐藥性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：構(gòu)建多藥耐藥基因(MDR1)的短發(fā)卡RNA(short hairpin RNA shRNA)表達(dá)質(zhì)粒，并檢測(cè)其對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞藥物敏感性的影響作用，為膠質(zhì)瘤的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 1．根據(jù)MDR1的DNA序列設(shè)計(jì)shRNA，3’端加入終止信號(hào)TTTTTT，兩端分別加入BamH Ⅰ和Hind Ⅲ的酶切位點(diǎn)，并加入LOOP環(huán)(UUCAAGAGA)形成shRNA結(jié)構(gòu)，克隆入pSilencer3.1-H1 neo質(zhì)粒

2、，建立shRNA表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)，酶切，測(cè)序鑒定正確后擴(kuò)增質(zhì)粒。 2．膠質(zhì)瘤干細(xì)胞培養(yǎng)傳代。 3．實(shí)驗(yàn)細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照，陰性質(zhì)粒對(duì)照組，MDR1組，Siport xp-1脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)分別選為轉(zhuǎn)染后第1，3，5，7天。 4．逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT—PCR)，Western Blotting在mRNA和蛋白水平檢測(cè)目的基因的表達(dá)。 5．對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)shRNA對(duì)多

3、藥耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用。 結(jié)果 1．成功構(gòu)建MDR1的shRNA表達(dá)質(zhì)粒，酶切，測(cè)序分析克隆成功，序列完全正確。 2．轉(zhuǎn)染后的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞成指數(shù)倍增長(zhǎng)。 3.轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組RT-PCR定量MDR1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平有所下降。100 nMshRNA治療組(49.3±4.8)％，與陰性對(duì)照組(98.7±9.8)％相比，(P<0.05)差異顯著；其與50nM shRNA治療組(78.1±5.9)％相比，(P<0.0

4、5)，差異顯著。實(shí)驗(yàn)組目的基因mRNA在第3天后表達(dá)明顯降低(P<0.05)，RT-PCR顯示MDR1抑制率第3，5，7天分別為78.46±14.17，82.02±11.87，79.51±13.27。 4.Westem blot顯示，shRNA轉(zhuǎn)染組P-糖蛋白(P-gp)的表達(dá)降低。顯示MDR1第3，5，7天抑制率分別為58.1±6.5，39.5±5.2，45.8±8.6 。 5.藥敏實(shí)驗(yàn)顯示，阿霉素、長(zhǎng)春新堿對(duì)轉(zhuǎn)染MD