人腦膠質(zhì)瘤及其腫瘤干細胞Livin基因與化療耐藥關(guān)系研究.pdf

1、第一部分、Livin基因表達與人腦膠質(zhì)瘤臨床病理學特征、細胞增殖及細胞凋亡的關(guān)系。 目的：探討Livin基因表達與人腦膠質(zhì)瘤臨床病理學特征及其與細胞凋亡、增殖的關(guān)系。 方法：41例人腦膠質(zhì)瘤組織，分為高度惡性組（Ⅲ級～Ⅳ級）23例和低度惡性組（Ⅰ級～Ⅱ級）18例，以10例正常腦組織做對照，應(yīng)用免疫組織化學技術(shù)檢測Livin蛋白和Ki67的表達，并分析記錄其標記指數(shù)(LI)和增殖指數(shù)(Ki67-PI)，應(yīng)用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)

2、移酶介導的X-dUTP缺口末端標記法(TUNEL)檢測細胞凋亡，并分析記錄其凋亡指數(shù)(AI)。 結(jié)果： ①41例膠質(zhì)瘤組織中l(wèi)ivin表達率為87.8％，10例正常腦組織中無Livin蛋白表達(P< 0.01)。Livin表達與膠質(zhì)瘤病理分級明顯相關(guān)(P< 0.05)，與膠質(zhì)瘤病理類型,是否復發(fā)無明顯相關(guān)（P>0.05）。 ②41例膠質(zhì)瘤中Ki67陽性率為56.1％（23/41），10例正常腦組織中無Ki67表達

3、(P< 0.01)。Ki67表達與膠質(zhì)瘤病理分級明顯相關(guān)(P<0.05)。 ③41例膠質(zhì)瘤和10例正常腦組織行凋亡檢測均有凋亡細胞檢出，膠質(zhì)瘤細胞凋亡較正常腦組織增加，平均AI分別為1.89（0.81～2.92）,0.37(0.15～0.67),二者有顯著性差異（P<0.01）。細胞凋亡隨著膠質(zhì)瘤病理分級升高而增加(P<0.05)。 ④Livin-LI與Ki67-PI、AI都隨著膠質(zhì)瘤的惡性程度升高而增加，相關(guān)分析顯示，

4、Livin-LI與Ki67-PI、Livin-LI與AI、Ki67-PI與AI均呈正相關(guān)（rs=1.000，P<0.01）。 結(jié)論：Livin基因通過在人腦膠質(zhì)瘤組織中表達，抑制細胞凋亡，參與細胞周期的調(diào)控，促進細胞增殖，使得細胞增殖占優(yōu)勢，造成腫瘤惡性表現(xiàn)，這可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。Livin在膠質(zhì)瘤中過表達，而在正常腦組織中不表達，其有望成為一種有效、敏感的瘤標，并為膠質(zhì)瘤的基因治療提供新靶點。Livin在膠質(zhì)

5、瘤復發(fā)中所扮演的角色還有待于今后進一步研究。 第二部分、人腦膠質(zhì)瘤干細胞分離、培養(yǎng)和鑒定及其Livin與多重耐藥基因的表達。 目的：從人腦膠質(zhì)瘤組織和人腦膠質(zhì)瘤細胞U251、TJ905、GL15中分離、培養(yǎng)和鑒定膠質(zhì)瘤干細胞，并探討二者的生物學特性及其抗凋亡和耐藥基因的表達差異。 方法：人腦膠質(zhì)瘤組織和人腦膠質(zhì)瘤細胞U251、TJ905、GL15經(jīng)過處理后，經(jīng)免疫磁珠分離獲取CD133+細胞，用無血清培養(yǎng)方法獲得

6、腫瘤干細胞球，用含有10％的胎牛血清培養(yǎng)誘導分化，分化前后分別做Nestin、tubulin -β、GFAP免疫細胞化學熒光染色，WST-8檢測細胞增殖活性，并觀察腫瘤干細胞形態(tài)學改變。同時，應(yīng)用實時熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測livin，livinα，Livinβ，survivin，MRP1和MRP3的表達。 結(jié)果： 人腦膠質(zhì)瘤組織和人腦膠質(zhì)瘤細胞U251、TJ905、GL15中含有CD133+細胞，這些細胞具有典型的

7、干細胞特性，Nestin染色為陽性；在無血清培養(yǎng)基中呈懸浮球樣生長，能夠自我更新和增殖，在有血清培養(yǎng)基中能夠分化，tubulin -β、GFAP染色為陽性，說明這些細胞可以分化成神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞。U251、GL15細胞與兩例膠質(zhì)瘤組織及其培養(yǎng)成功的腫瘤干細胞分別檢測livin、livinα、livinβ和MRP-1、MRP-3mRNA表達量后發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細胞比較其同源的膠質(zhì)瘤組織或細胞livin、livinα、livinβ、Surv

8、ivin和MRP-1表達量明顯增加；TJ905腫瘤干細胞livin、livinα、livinβ、Survivin、MRP-1、MRP-3表達量較TJ905單層培養(yǎng)細胞表達量都有不同程度的降低。 結(jié)論：從人腦膠質(zhì)瘤組織和人腦膠質(zhì)瘤細胞U251、TJ905、GL15中成功分離培養(yǎng)了腫瘤干細胞，并能在體外進行增殖和分化，這為進一步研究膠質(zhì)瘤干細胞生物學特性提供實驗載體。TJ905干細胞球抗凋亡和MRP基因表達量較TJ905單層培養(yǎng)細胞

9、表達量都有不同程度的降低，這與本文研究U251、GL15細胞與兩例膠質(zhì)瘤組織及其培養(yǎng)成功的與其同源的腫瘤干細胞結(jié)果不一致。這個現(xiàn)象是有啟發(fā)意義的，說明干細胞分化和去分化過程中有很多的不確定因素影響整個進程。這似乎也提示腫瘤干細胞在腫瘤耐藥機制中發(fā)揮的作用不盡相同，也不總是造成腫瘤耐藥的唯一因素，這需要在今后的研究中進一步探明。 第三部分、化療藥物對人腦膠質(zhì)瘤細胞及其腫瘤干細胞Livin基因表達的影響。 目的：探討化療藥物

10、對人腦膠質(zhì)瘤細胞及其腫瘤干細胞livin、MRP基因表達的影響，并分析livin基因表達與化療耐藥的關(guān)系。 方法：利用人腦膠質(zhì)瘤細胞U251及其分離成功的腫瘤干細胞，分別用不同濃度的化療藥物（尼莫司汀Nimustine、紫杉醇Taxol、依托泊甙Etoposide、卡鉑Carboplatin）進行干預48h后，應(yīng)用實時熒光定量的RT-PCR技術(shù)檢測livin、survivin、MRP基因的表達量，采用WST-8法測定細胞增殖和細

11、胞毒性，流式細胞儀測定細胞周期變化，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，共聚焦顯微鏡觀察凋亡和死亡細胞。 結(jié)果：藥物干預后的U251細胞及其腫瘤干細胞增殖受到明顯抑制，細胞形態(tài)發(fā)生變化，見散在細胞碎片，隨著藥物濃度的增加,細胞（球）量明顯減少；腫瘤干細胞比較其同源的U251細胞表現(xiàn)了更強的耐藥性，同一濃度藥物干預后的細胞存活率腫瘤干細胞比較其同源的U251細胞差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；同一濃度藥物干預后的腫瘤干細胞比較其同源

12、的U251細胞，腫瘤干細胞凋亡細胞和死亡細胞減少，活細胞增加，其差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；同一藥物濃度干預的腫瘤干細胞比較其同源的U251細胞，腫瘤干細胞livin、livinβ和MRP-1、MRP-3 mRNA表達量增加，而livinα、Survivin mRNA表達量降低，其差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 結(jié)論：藥物干預后的U251細胞及其腫瘤干細胞增殖受到明顯抑制，腫瘤干細胞與其同源的U251細胞比較livin