人可溶性TRAIL的基因克隆及其抑制C6膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、浙江大學(xué)博士學(xué)位論文人可溶性TRAIL的基因克隆及其抑制C6膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究姓名：裘五四申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：外科學(xué)（神經(jīng)外科）指導(dǎo)教師：劉偉國(guó)楊小鋒20070516浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文一裘五四中英文摘要2、引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)，用引物設(shè)計(jì)軟件DNAstar設(shè)計(jì)sTRAIL基因引物如下：上游：5GCGAATTCAGl=ATGGTGAGAGAAAGAGGTC3；下游：5ACAG，I姍A=rCCrCCAGGTCAGr聃。(

2、挖CA3。3、總RNA提取與目的基因的克隆無(wú)菌條件下取小塊人脾臟組織，碾磨勻漿，嘲zol一步法提取總RNA。嚴(yán)格按照AccessRTPCRSystem說(shuō)明書(shū)，以人脾臟總RNA為模板由下游弓l物引導(dǎo)，進(jìn)行RT反應(yīng)。以RT產(chǎn)物為模板，由上述上、下游引物引導(dǎo)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCRj6：物電泳，將540bp附近出現(xiàn)的特異性條帶切膠回收、提純即得到目的基因。將目的基因連接PuCm—T載體并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增，獲得純化質(zhì)粒并初步酶切鑒定后

3、送上海生工公司進(jìn)彳亍序列測(cè)定。4、構(gòu)建真核表達(dá)載體TsTRAIL經(jīng)測(cè)序鑒定證實(shí)克隆成功，EcoRI和BamH4雙酶切，切膠回收541bp的sTRAIL片段。與EcoR_I和BanlHI雙酶切的真核表達(dá)載體PcDNA31連接。所得重組質(zhì)粒命名為PcDNAsTRAIL。5、PcDNA椰AⅡ?qū)δz質(zhì)瘤增殖的影響：利用Mrr等技術(shù)，體外檢測(cè)PeDNAsTRAIL轉(zhuǎn)染后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用；建立裸鼠膠質(zhì)瘤模型，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察PcDNAmAⅡ尉膠質(zhì)瘤

4、的治療作用。結(jié)果l、無(wú)菌條件下提取小塊人脾臟組織總RNA，經(jīng)凝膠電泳，EB染色，紫外線燈下28S和18S條帶清晰可見(jiàn)，提示RNA降解。2、RTPCR結(jié)果PcR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳與分子質(zhì)量標(biāo)記比較顯示約可見(jiàn)540bp處有一特異性條帶，與預(yù)期sTRAIL基因分子量吻合，切膠回收。3、酶切鑒定與序列測(cè)定TsTRAIL經(jīng)EcoRI和BamhI雙酶切，電泳可見(jiàn)兩條特異性條帶，大小分別為Ikb和540bp左右，與預(yù)期(大小分別為Ikb和541bp)符合