大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞治療C6膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，約占顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的40％，成侵襲性生長(zhǎng)，不易完全切除，術(shù)后易復(fù)發(fā)，預(yù)后差。干細(xì)胞在特定環(huán)境下，可以向腫瘤或損傷區(qū)域遷移運(yùn)動(dòng)，干細(xì)胞的移植可靶向性的治療疾病。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCc)是存在于骨髓中的具有自我更新和多向分化潛能的非造血干細(xì)胞，可誘導(dǎo)分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、表皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等；而且其培養(yǎng)技術(shù)和條件相對(duì)簡(jiǎn)單，來源廣、取材容易、傳代穩(wěn)定，避開了免疫排斥和倫理障礙，是干細(xì)胞研

2、究中的新秀。BMSCs與其它干細(xì)胞一樣可以分泌細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)因子和細(xì)胞活素類物質(zhì)，如干細(xì)胞因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、白介素及干擾素等；BMSCs的多向分化潛能可以促進(jìn)病變區(qū)域的功能恢復(fù)，同時(shí)向病變部位遷移；而且有研究證實(shí)BMSCs可以進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)而不受到血腦屏障的影響。本研究通過其對(duì)在體內(nèi)體外C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)情況和治療效果進(jìn)行觀察，為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在顱內(nèi)病變時(shí)行細(xì)胞的替代治療做探索性研究。
　　1.大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定和

3、標(biāo)記
　　目的：通過穩(wěn)定可靠的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)模型（全細(xì)胞培養(yǎng)法）培養(yǎng)擴(kuò)增獲得純化的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。方法：無菌取SD大鼠骨髓液并移至培養(yǎng)瓶，加入DMED/F12+10％FBS培養(yǎng)液，原代靜置培養(yǎng)48h后半量換液；以后正常換液，待細(xì)胞鋪滿瓶底80％左右時(shí)進(jìn)行傳代。第4代細(xì)胞形態(tài)較為均一，MTT法測(cè)定細(xì)胞活性和繪制生長(zhǎng)曲線，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMSCs表面標(biāo)記CD14、CD34、CD45、CD29、CD90、

4、CD105表達(dá)率。結(jié)果：在培養(yǎng)初期可見大量懸浮細(xì)胞，48h后可見有散在紡錘形或梭形貼壁細(xì)胞；第4代后細(xì)胞呈形態(tài)均一的紡錘形或梭形，分布均勻。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線可見細(xì)胞呈一種持續(xù)的增殖狀態(tài)，培養(yǎng)4－6天后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。行流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原標(biāo)記，顯示為體形均一的細(xì)胞群，CD14、CD34、CD45的表達(dá)率分別為2.4％、1.6％、2.7％，為陰性；CD29、CD90、CD105的陽性率分別為98.9％、99.5％、99.1％，為陽性。

5、結(jié)論：通過體外骨髓的全細(xì)胞培養(yǎng)的方法可獲得高純度的BMSCs，并可在體外穩(wěn)定培養(yǎng)。
　　2.體外鼠BMSCs對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的趨向性及抑制作用
　　目的：探討B(tài)MSCs在體外微環(huán)境下對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的趨向性，并初步研究BMSCs在體外微環(huán)境下對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。方法：BMSCs與C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞以Transwell法共培養(yǎng)72h，對(duì)遷移的BMSCs行HE染色并對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞行Weston法檢測(cè)細(xì)胞凋亡；每12h對(duì)

6、C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞行MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。結(jié)果：遷移的BMScs行HE染色示Transwell培養(yǎng)板小室下面存在大量的遷移細(xì)胞；WestonBlot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，共培養(yǎng)組C6細(xì)胞的抗凋亡蛋白Bcl2表達(dá)水平明顯下降，同時(shí)促凋亡蛋白Caspase3表達(dá)水平明顯升高（P<0.01）；MTT法繪制生長(zhǎng)曲線示實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖抑制（P＜0.05）。結(jié)論：BMSCs在體外微環(huán)境下對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有明顯的趨向性，

7、可能影響C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞生存的微環(huán)境，也可以用來作為目的基因或藥物的載體；BMSCs在體外微環(huán)境下對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞存在抑制生長(zhǎng)的作用，流式細(xì)胞法檢測(cè)比較明顯，而MTT法生長(zhǎng)曲線不明顯，可能是時(shí)間段間隔較短或者細(xì)胞數(shù)量較少的原因。
　　3.體內(nèi)鼠BMSCs對(duì)C6膠質(zhì)瘤的治療作用
　　目的：建立C6膠質(zhì)瘤模型，通過在體實(shí)驗(yàn)探討B(tài)MSCs在體內(nèi)環(huán)境下對(duì)C6膠質(zhì)瘤趨向性及生長(zhǎng)的抑制及其對(duì)荷瘤大鼠的機(jī)體功能和生存周期的影響,觀察其治療效

8、果。方法：體外培養(yǎng)大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，立定定向接種1.0×106個(gè)/10μC6膠質(zhì)瘤細(xì)胞于SD大鼠右側(cè)尾狀核，建C6膠質(zhì)瘤的SD大鼠荷瘤模型；1周后向左側(cè)側(cè)腦室注射BrdU標(biāo)記的BMSCs；觀察2個(gè)月，記錄大鼠機(jī)體功能變化和生存情況，SD大鼠生存周期繪成Kaplan-Meier圖，組間差異行Log-rankTest(時(shí)序檢驗(yàn))；大鼠自然死亡后行HE染色和BrdU免疫組化染色，檢測(cè)膠質(zhì)瘤的情況和BMSCs對(duì)膠質(zhì)瘤的趨向性。結(jié)果：接種一周后

9、，各組大鼠精神差，活動(dòng)減少，飲食減少，體重漸減，自然死亡前肢體不自主抽動(dòng)，實(shí)驗(yàn)組各大鼠各種機(jī)體功能減退及體重減輕較對(duì)照組輕，飲食量相對(duì)大；各組成瘤率為100％；對(duì)照組各鼠在60天內(nèi)均死亡，中位生存期為20.05±1.087d；治療組中位生存期為31.55±3.092d，其中有2只長(zhǎng)期存活>60d，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但在早期實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組生存周期延長(zhǎng)并不明顯。HE染色結(jié)果示實(shí)驗(yàn)組C6膠質(zhì)瘤瘤體較對(duì)照組小，而且腫瘤邊緣向周圍腦