內皮-單核細胞激活多肽Ⅱ選擇性增加血腫瘤屏障通透性的作用和機制.pdf

1、目的：腦神經(jīng)膠質瘤是一種最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤,術后化療是目前治療腦腫瘤的主要手段。但是由于正常腦組織中血腦屏障(blood-brain barrier,BBB),以及腫瘤組織中血腫瘤屏障(blood-tumor barrier,BTB)的存在,嚴重限制了抗腫瘤藥物進入到腫瘤組織。因此有效地增加腫瘤組織中抗腫瘤藥物的濃度,是提高化療藥物療效的關鍵。
　　 內皮-單核細胞激活多肽Ⅱ(endothelial-monocyte

2、activating polypeptideⅡ,EMAPⅡ)是從甲基膽蒽A誘導形成的纖維肉瘤細胞的上清中發(fā)現(xiàn)的致炎因子,具有促進細胞凋亡和抑制腫瘤血管生成的特性。目前EMAPⅡ主要被用于腫瘤治療的實驗研究。有研究表明低劑量的EMAPⅡ可以通過調節(jié)內皮細胞上的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNT)受體1,增加TNFα對腫瘤微血管內皮細胞的作用,TNFα不僅能夠抑制腫瘤的生長、侵襲,還可以在一定程度上增加BBB的

3、通透性。
　　 RhoA/ROCK信號通路在內皮細胞通透性的改變中起主要的調控作用,并且絲狀肌動蛋白(filamentous actin,F-actin)細胞骨架結構的變化是調節(jié)內皮細胞通透性的重要機制。有研究發(fā)現(xiàn),EMAPⅡ可誘導人臍靜脈內皮細胞骨架蛋白F-actin的重排,使肌動蛋白形成廣泛的應力纖維和更多的粘著斑。肌動蛋白的結構和功能的變化能夠影響內皮細胞間緊密連接(tight junction,TJ)復合體,進而影響B(tài)B

4、B的通透性,當肌動蛋白的應力纖維和粘著斑形成增加時,會通過影響TJ相關蛋白以及細胞骨架蛋白開放TJ,從而引起B(yǎng)BB的通透性增加。
　　 本研究的目的是研究EMAPⅡ是否能夠增加腦膠質瘤BTB的通透性,以及RhoA/ROCK信號通路是否參與這一過程。
　　 方法：
　　 1、大鼠C6膠質瘤模型和體外BTB模型的制備。
　　 2、應用伊文思蘭(evans blue,EB)滲透評估EMAPⅡ作用后腦膠質瘤大鼠B

5、TB滲透性變化。
　　 3、測量體外BTB模型的跨內皮阻抗(transendothelial electric resistance,TEER)值和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)流量,檢測給予EMAPⅡ作用后以及RhoA特異性抑制劑肉毒梭菌C3胞外酶(Clostridium botulinum C3exoenzyme)和Rho激酶(Rho associated Kinase,ROCK)特異

6、性抑制劑Y-27632預處理后體外BTB通透性的變化。
　　 4、應用RT-PCR、免疫組織化學法及western blot法檢測給予EMAPⅡ作用后大鼠C6膠質瘤模型中微血管TJ相關蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的mRNA以及蛋白表達水平變化。
　　 5、應用免疫熒光法檢測給予EMAPⅡ作用1h后以及C3胞外酶、Y-27632預處理后,ZO-1、occludin、claudin-5以及F-actin

7、的分布和表達水平的變化。
　　 6、應用western blot法檢測EMAPⅡ作用后及C3胞外酶、Y-27632預處理后體外BTB模型上TJ相關蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的蛋白表達水平;并且檢測磷酸化的肌球蛋白輕鏈(myosin light chain,MLC)、肌動蛋白素(cofilin)和總MLC、cofilin的表達。
　　 7、應用Pull-down方法檢測體外BTB模型上EMAPⅡ作用

8、后RhoA活性變化。
　　 結果：
　　 1、成功建立了大鼠C6腦膠質瘤模型和體外BTB模型。
　　 2、EMAPⅡ作用后,C6腦膠質瘤大鼠BTB通透性增加,體外BTB模型的TEER值顯著降低,HRP流量顯著增加。上述指標在EMAPⅡ作用1 h時變化最明顯。體外BTB模型中經(jīng)C3 exoenzyme或Y-27632預處理后,TEER值以及HRP流量均顯著恢復。
　　 3、EMAPⅡ作用后,C6腦膠質瘤大鼠

9、腦組織中微血管TJ相關蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的mRNA和蛋白表達均減少,在1 h時達最低值。體外BTB模型中上述蛋白的表達變化與在體的變化一致。
　　 4、EMAPⅡ作用后,體外BTB模型上的內皮細胞TJ相關蛋白ZO-1、occludin和claudin-5由連續(xù)分布狀態(tài)變?yōu)椴贿B續(xù)分布,ZO-1、occludin和claudin-5在細胞邊緣表達水平下降并且發(fā)生由細胞邊緣向細胞質的轉移;細胞骨架蛋白F

10、-actin沿細胞邊緣的分布減少,應力纖維增加。C3胞外酶和Y-27632預處理后,內皮細胞中ZO-1、occludin和claudin-5部分恢復連續(xù)分布狀態(tài),并且三者的表達水平顯著恢復;F-actin沿細胞邊緣的分布明顯增多,應力纖維明顯減少。
　　 5、EMAPⅡ作用后,體外BTB模型上的內皮細胞RhoA活性從0.25 h開始增加,0.5 h達峰值,之后逐漸減少。
　　 6、EMAPⅡ作用后,體外BTB模型上的內皮

11、細胞MLC和cofilin磷酸化水平從0.25 h時開始增加,1 h時達峰值,之后逐漸減少。C3胞外酶或Y-27632預處理后MLC和cofilin磷酸化水平顯著恢復。
　　 7、不同病理級別人腦膠質瘤中MMP-7和MMP-14的表達與ERK1/2的磷酸化顯著正相關。
　　 討論：
　　 本研究首次證明,EMAPⅡ作用后,BTB通透性顯著增加,TJ相關蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的mRNA和

12、蛋白表達均顯著減少,在EMAPⅡ作用1 h達最低值,TJ相關蛋白和細胞骨架蛋白F-actin的分布也發(fā)生改變,并且RhoA活性、MIC和cofilin磷酸化水平顯著升高。應用RhoA的特異性抑制劑C3胞外酶和ROCK的特異性抑制劑Y-27632進行預處理后,顯著抑制了BTB的通透性升高,顯著抑制了TJ相關蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表達降低,明顯改變了TJ相關蛋白的重分布和細胞骨架F-actin的重排,顯著抑制了

13、MLC和cofilin磷酸化水平的升高。上述結果說明EMAPⅡ能夠通過下調TJ相關蛋白ZO-1,occludin和claudin-5的表達選擇性增加BTB通透性;并且RhoA/ROCK信號通路在EMAPⅡ介導的BTB通透性增加的過程起重要的調節(jié)作用;RhoA/ROCK通路的下游信號分子MLC和cofilin也參與了上述調節(jié)過程。
　　 以往的研究表明,小劑量緩激肽(bradykinin,BK)能夠有效增加BTB通透性,而不影響正

14、常腦組織。盡管小劑量BK能夠顯著增加BTB通透性,但是其增加BTB通透性的持續(xù)時間短暫,大約20分鐘。因此,小劑量BK作為一種增加BTB通透性的物質,其臨床應用受到限制。本研究結果顯示EMAPⅡ作用后,BTB通透性從0.5 h開始增加,在1 h達到峰值,然后降低,6 h后基本恢復到未處理前水平。我們發(fā)現(xiàn)EMAPⅡ增加BTB通透性的持續(xù)時間明顯長于BK的作用時間。因此,這一發(fā)現(xiàn)可能為選擇性開放BTB以及增加抗腫瘤藥物轉運至腫瘤組織提供了新

15、方法。
　　 研究表明TJ是維持體內BBB完整性的重要結構和功能基礎,并且在調節(jié)細胞旁通透性方面起重要作用。在BBB中,位于內皮細胞之間的TJ復合物是由如下蛋白組成的,occludin,claudins,Zos和連接粘附分子,這些結構的改變在調節(jié)TJ功能方面起重要作用。最近的研究顯示,F-actin在TJ復合物的結構支持和功能調節(jié)方面起重要作用。本研究結果顯示,EMAPⅡ作用后TJ相關蛋白ZO-1,occludin和claudi

16、n-5的mRNA和蛋白表達顯著降低,最低水平出現(xiàn)在EMAPⅡ作用后1 h,上述TJ相關蛋白由連續(xù)分布狀態(tài)變?yōu)椴贿B續(xù)分布狀態(tài),發(fā)生由細胞邊緣向細胞質轉移;細胞骨架蛋白F-actin沿細胞邊緣的分布減少,應力纖維增加。因此,我們認為EMAPⅡ能夠通過影響細胞骨架蛋白F-actin的重排進而調節(jié)TJ相關蛋白ZO-1,occludin和claudin-5的結構和功能,最終引起TJ開放。
　　 研究表明在一些細胞外刺激下,TJ能發(fā)生快速分

17、解和重組。RhoA/ROCK信號通路是細胞外信號誘導細胞骨架蛋白F-actin重排的分子開關,參與內皮細胞通透性的調節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn),EMAPⅡ可誘導人臍靜脈內皮細胞骨架蛋白F-actin的重排,使肌動蛋白形成廣泛的應力纖維和更多的粘著斑。當肌動蛋白的應力纖維和粘著斑形成增加時,會通過影響TJ相關蛋白以及細胞骨架蛋白開放TJ,從而引起B(yǎng)BB的通透性增加。本研究結果顯示EMAPⅡ作用后,RhoA活性、MLC和cofilin磷酸化水平均升高。

18、應用RhoA的特異性抑制劑C3胞外酶和ROCK的特異性抑制劑Y-27632進行預處理后,顯著抑制了BTB通透性的升高,顯著抑制了TJ相關蛋白ZO-1、occludin和claudin-5表達的降低,顯著抑制了TJ相關蛋白的重分布和細胞骨架F-actin的重排,顯著抑制了MLC和cofilin磷酸化水平的升高。上述結果說明RhoA/ROCK-MLC通路和RhoA/ROCK-cofilin通路參與EMAPⅡ介導的細胞骨架蛋白F-actin重

19、排,TJ相關蛋白表達降低及重分布以及BTB通透性增高的過程。
　　 上述結果證明,EMAPⅡ能夠通過下調TJ相關蛋白ZO-1,occludin和claudin-5的表達選擇性增加BTB通透性,并且RhoA/ROCK信號通路在EMAPⅡ介導的BTB通透性增加的過程起重要的調節(jié)作用。RhoA/ROCK通路的下游信號分子MLC和cofilin也參與了上述調節(jié)過程。
　　 結論：
　　 1、EMAPⅡ能夠選擇性增加BTB

20、通透性。
　　 2、EMAPⅡ增加BTB通透性,可能與EMAPⅡ顯著降低TJ相關蛋白ZO-1,occludin,claudin-5的mRNA和蛋白表達水平相關。
　　 3、RhoA/ROCK信號途徑參與EMAPⅡ選擇性增加BTB通透性的調節(jié)過程。
　　 4、MLC和cofilin參與EMAPⅡ增加BTB通透性的調節(jié)過程,且為RhoA/ROCK的下游信號因子。
　　 5、不同病理級別人腦膠質瘤中MMP-7和