SwiprosiN-1在血脈屏障通透性調(diào)節(jié)中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、血腦屏障(Blood-brain barrier, BBB)，是指位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外周血液循環(huán)之間由多種細(xì)胞與非細(xì)胞成分共同構(gòu)成的血管組織結(jié)構(gòu)，主要功能由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞承載，其他種類細(xì)胞（如星形膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、小膠質(zhì)細(xì)胞以及神經(jīng)元等）圍繞腦微血管周圍，共同輔助內(nèi)皮細(xì)胞起作用。其主要的功能為限制物質(zhì)進(jìn)出中樞神經(jīng)系統(tǒng)，保持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)部環(huán)境的穩(wěn)定性。血腦屏障通透性功能的破壞在幾乎所有的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中有所發(fā)生，這會(huì)導(dǎo)致

2、大量外周血液中的成分進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，進(jìn)一步加劇疾病病程惡化。同時(shí)，研究如何可控的增加血腦屏障通透性，對(duì)于藥物到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有重要意義。因此，尋找新型調(diào)節(jié)血腦屏障通透性的靶點(diǎn)具有重要意義。
　　研究目的:
　　我們課題組在大腦皮質(zhì)中發(fā)現(xiàn)一種新型蛋白swiprosin-1，其主要集中表達(dá)于腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中。Swiprosin-1是2004年首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)的小分子量蛋白，目前關(guān)于該蛋白的研究主要集中見(jiàn)于

3、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)方面，該蛋白在其他方面作用知之甚少。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)swiprosin-1后發(fā)現(xiàn)緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)明顯減少，由于腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞是構(gòu)成血腦屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，緊密連接蛋白對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞通透性具有重要調(diào)節(jié)作用。據(jù)此，我們推測(cè)swiprosin-1在血腦屏障通透性調(diào)節(jié)過(guò)程中起到作用。本課題旨在研究swiprosin-1在血腦屏障通透性調(diào)節(jié)過(guò)程中如何發(fā)揮作用，明確其在血腦屏障通透性調(diào)節(jié)過(guò)程中的機(jī)制，為

4、進(jìn)一步尋找調(diào)節(jié)血腦屏障通透性的新靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。
　　內(nèi)容與方法:
　　一、Swiprosin-1在腦皮質(zhì)中的表達(dá)定位及其在不同動(dòng)物模型中的表達(dá)差異
　　1.利用免疫印跡技術(shù)觀察swiprosin-1在正常小鼠全身不同組織器官中的表達(dá)含量;
　　2.利用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)swiprosin-1在大腦中表達(dá)分布情況;
　　3.體外培養(yǎng)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMEC)，利用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)swiprosin

5、-1在其中表達(dá)分布;
　　4.制作三種增加血腦屏障通透性的動(dòng)物模型:分別是大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)、LPS處理誘發(fā)全身性免疫反應(yīng)、冷凍損傷，尾靜脈注射伊文思藍(lán)，體外直接觀察與熒光下檢測(cè)明確其血腦屏障功能破壞;
　　5.免疫熒光檢測(cè)三種動(dòng)物模型中claudin-5、VE-cadherin、caveolin-1表達(dá)差異;
　　6.免疫印跡檢測(cè)三種血腦屏障通透性增加的動(dòng)物模型中swiprosin-1表達(dá)變化;
　　7

6、.免疫印跡檢測(cè)BMEC缺糖缺氧(OGD)后swiprosin-1表達(dá)。
　　二、Swiprosin-1高表達(dá)與低表達(dá)對(duì)血腦屏障通透性的影響
　　1.構(gòu)建swiprosin-1敲除小鼠，尾靜脈注射伊文思藍(lán)后，與野生型小鼠相比，兩組大腦中伊文思藍(lán)滲出差異;
　　2.構(gòu)建swiprosin-1基因過(guò)表達(dá)小鼠，尾靜脈注射伊文思藍(lán)后，與野生型小鼠相比，熒光定性及定量比較兩組大腦中伊文思藍(lán)滲出差異;
　　3.對(duì)swipros

7、in-1基因敲除小鼠施行MCAO手術(shù)，術(shù)后22h尾靜脈注射伊文思藍(lán)，熒光定性和定量比較兩組大腦中伊文思藍(lán)滲出。
　　三、Swiprosin-1對(duì)血腦屏障通透性調(diào)節(jié)作用的機(jī)制研究
　　1.免疫組織熒光染色定性比較swiprosin-1過(guò)表達(dá)小鼠與野生型小鼠在生理狀況下緊密連接蛋白o(hù)ccludin、ZO-1分布;
　　2.免疫印跡定量比較swiprosin-1過(guò)表達(dá)小鼠與野生型小鼠在生理狀況下大腦皮質(zhì)中緊密連接蛋白o(hù)ccl

8、udin、ZO-1及claudin-5表達(dá);
　　3.免疫組織熒光染色定性比較swiprosin-1敲除鼠MCAO后梗死區(qū)與非梗死區(qū)緊密連接蛋白o(hù)ccludin、ZO-1分布表達(dá)，及伊文思藍(lán)浸潤(rùn)區(qū)域;
　　4.免疫印跡定量比較swiprosin-1敲除鼠MCAO后梗死區(qū)與非梗死區(qū)緊密連接蛋白o(hù)ccludin、ZO-1表達(dá);
　　5.免疫印跡檢測(cè)Swiprosin-1過(guò)表達(dá)小鼠大腦皮質(zhì)中ROCK-1蛋白表達(dá);
　　

9、6.免疫印跡檢測(cè)BMEC中過(guò)表達(dá)swiprosin-1后緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)，以及給予ROCK-1抑制劑Y27632后ZO-1蛋白表達(dá)變化;
　　7.免疫印跡檢測(cè)Swiprosin-1敲除小鼠MCAO后，大腦皮質(zhì)梗死區(qū)與對(duì)照區(qū)域ROCK-1表達(dá);
　　8.免疫印跡檢測(cè)干擾swiprosin-1的BMEC中，OGD處理6h后ZO-1表達(dá);
　　9.免疫印跡檢測(cè)OGD處理BMEC6h后，連接蛋白ZO-1、occludi

10、n表達(dá)變化，及給予Y27632后連接蛋白ZO-1及occludin表達(dá)變化;
　　10.免疫共沉淀檢測(cè)野生型小鼠腦皮質(zhì)中swiprosin-1與ZO-1相互作用關(guān)系。
　　四、體外實(shí)驗(yàn)探究swiprosin-1調(diào)節(jié)BMEC中緊密連接蛋白及骨架蛋白的作用
　　1.免疫熒光檢測(cè)BMEC中過(guò)表達(dá)swiprosin-1后occludin、ZO-1分布改變，及與給藥Y27632后分布改變;
　　2.免疫熒光檢測(cè)BMEC中過(guò)

11、表達(dá)swiprosin-1后claudin-5分布改變，及與給藥Y27632后分布改變;
　　3.免疫熒光檢測(cè)BMEC中過(guò)表達(dá)swiprosin-1后細(xì)胞骨架蛋白F-actin分布改變，及與給藥Y27632后分布改變;
　　4.免疫熒光檢測(cè)BMEC中OGD處理6h后ZO-1分布改變，及與給藥Y27632后ZO-1分布改變;
　　5.免疫熒光檢測(cè)BMEC中OGD處理6h后骨架蛋白F-actin分布，及與給藥Y27632后

12、F-actin分布改變。
　　五、Swiprosin-1對(duì)BMEC其他內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)功能的影響
　　1.免疫熒光觀察BMEC中干擾swiprosin-1，OGD6h后細(xì)胞形態(tài);
　　2.BMEC過(guò)表達(dá)swiprosin-1后，細(xì)胞形態(tài)觀察及遷移活性定量檢測(cè);
　　3.BMEC過(guò)表達(dá)swiprosin-1后，細(xì)胞小管新生能力定量檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　一、成功制作三種病理性增加血腦屏障通透性的動(dòng)物模型并檢

13、測(cè)swiprosin-1表達(dá)
　　1.Swiprosin-1在全身多組織器官中存在表達(dá)，其中大腦、小腦、延髓、間腦等中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織均表達(dá);
　　2.Swiprosin-1主要分布于大腦皮質(zhì)中的腦血管中;
　　3.原代BMEC表達(dá)swiprosin-1，且主要分布于胞質(zhì)中;
　　4.成功制作了MCAO、LPS處理誘發(fā)全身性免疫反應(yīng)、冷凍損傷三種增加血腦屏障通透性動(dòng)物模型。模型動(dòng)物尾靜脈注射伊文思藍(lán)后，整個(gè)腦組織可

14、見(jiàn)明顯藍(lán)色浸潤(rùn)，切片熒光下可以檢測(cè)到紅色熒光;
　　5.三種動(dòng)物模型中claudin-5、VE-cadherin表達(dá)均下調(diào)，caveolin-1表達(dá)上調(diào);
　　6.三種血腦屏障通透性增加的動(dòng)物模型中，大腦皮質(zhì)swiprosin-1表達(dá)上調(diào);
　　7.BMEC中OGD處理后swiprosin-1表達(dá)量隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，1h后顯著上調(diào)，4h時(shí)表達(dá)最高，至6h達(dá)到穩(wěn)定。
　　二、Swiprosin-1影響血腦屏

15、障通透性
　　1.與野生型小鼠相比，swiprosin-1敲除鼠生理狀態(tài)下血腦屏障通透性無(wú)明顯變化;
　　2.與野生型小鼠相比，swiprosin-1過(guò)表達(dá)鼠生理狀態(tài)下血腦屏障通透性明顯增加;
　　3.與野生型小鼠相比，swiprosin-1敲除鼠MCAO術(shù)后伊文思藍(lán)滲出明顯減少。
　　三、Swiprosin-1通過(guò)緊密連接蛋白調(diào)節(jié)血腦屏障通透性
　　1.Swiprosin-1過(guò)表達(dá)小鼠大腦皮質(zhì)血管中緊密連

16、接蛋白o(hù)ccludin、ZO-1不連續(xù)分布;
　　2.Swiprosin-1過(guò)表達(dá)小鼠大腦皮質(zhì)中occludin、ZO-1表達(dá)減少，claudin-5表達(dá)不變;
　　3.與野生型小鼠相比，swiprosin-1敲除鼠MCAO術(shù)后腦梗死區(qū)域occludin、ZO-1分布更為完整，伊文思藍(lán)集中于血管內(nèi)分布，腦實(shí)質(zhì)中浸潤(rùn)較少;
　　4.與野生型小鼠相比，swiprosin-1敲除鼠MCAO術(shù)后腦梗死區(qū)域occludin、ZO

17、-1表達(dá)降低程度減輕;
　　5.與野生型小鼠相比，Swiprosin-1過(guò)表達(dá)鼠大腦中ROCK-1含量顯著增高;
　　6.細(xì)胞水平，過(guò)表達(dá)swiprosin-1后，BMEC中ZO-1表達(dá)顯著降低;給予Y27632，ZO-1表達(dá)顯著增加;
　　7.Swiprosin-1野生型鼠MCAO術(shù)后，大腦皮質(zhì)梗死區(qū)域ROCK-1表達(dá)顯著增加;在swiprosin-1敲除型鼠中，兩者無(wú)顯著差異;
　　8.與空白病毒組相比，BM

18、EC干擾swiprosin-1后，OGD處理6h時(shí)，ZO-1表達(dá)顯著增加;
　　9.BMEC中，OGD損傷6h后occludin、ZO-1表達(dá)顯著下調(diào)，給予Y27632可抑制OGD損傷造成的occludin、ZO-1表達(dá)下調(diào);
　　10.Swiprosin-1野生型鼠腦皮質(zhì)中swiprosin-1與ZO-1存在蛋白蛋白相互作用。
　　四、Swiprosin-1影響B(tài)MEC中緊密連接蛋白及骨架蛋白分布
　　1.BM

19、EC中過(guò)表達(dá)swiprosin-1后，緊密連接蛋白o(hù)ccludin、ZO-1分布連續(xù)性減弱，Y27632可抑制occludin、ZO-1分布連續(xù)性減弱;
　　2.BMEC中過(guò)表達(dá)swiprosin-1后，緊密連接蛋白claudin-5分布無(wú)明顯變化;
　　3.BMEC中過(guò)表達(dá)swiprosin-1后，細(xì)胞骨架蛋白F-actin分布趨向胞膜，Y27632可抑制F-actin分布趨向胞膜;
　　4.BMEC中OGD損傷6h

20、，后緊密連接蛋白ZO-1分布連續(xù)性破壞，Y27632可抑制ZO-1分布連續(xù)性破壞;
　　5.BMEC中OGD損傷6h后，細(xì)胞骨架蛋白F-actin分布趨向胞膜，Y27632可抑制F-actin分布趨向胞膜。
　　五、Swiprosin-1調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能
　　1.BMEC中OGD損傷6h后，細(xì)胞形態(tài)雜亂，細(xì)胞皺縮明顯。Y27632可減弱此種刺激下細(xì)胞形態(tài)的改變;
　　2.BMEC中OGD損傷6h后，細(xì)胞形態(tài)改變明

21、顯，干擾swiprosin-1后可以減弱細(xì)胞形態(tài)改變;
　　3.BMEC中過(guò)表達(dá)swiprosin-1后，細(xì)胞胞體伸出偽足，提示遷移能力增強(qiáng);
　　4.BMEC中過(guò)表達(dá)swipro sin-1后，細(xì)胞遷移能力增強(qiáng);
　　5.BMEC中過(guò)表達(dá)swiprosin-1后，小管新生能力無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論:
　　1.Swiprosin-1是影響血腦屏障通透性的一個(gè)重要蛋白;
　　2.Swiprosin-1主