Aqp3對膿毒癥肺血管通透性的調節(jié)作用及機制.pdf

1、膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應，可引起嚴重的器官功能衰竭，其發(fā)病率和死亡率均很高，嚴重威脅人類生命健康。血管通透性增加是膿毒癥重要的病理生理過程，是導致器官功能損傷的重要原因之一。關于膿毒癥血管通透性的機制與防治有大量研究，并在臨床取得一定的效果，但還有待進一步闡明。
　　水通道蛋白(Aquaporin，Aqp)是一種能介導水快速進出細胞的膜轉運蛋白，在大鼠體內有12種亞型，各亞型在各器官表達和功能不一。研究發(fā)現(xiàn)Aqp除作為通道

2、調節(jié)水和甘油及其他小分子物質進出細胞外，還能作為細胞信號分子介導細胞的遷移、分化、分泌等功能。目前研究發(fā)現(xiàn)Aqps在腦缺血缺氧再灌注損傷、腫瘤、腎病、視網(wǎng)膜損傷及干燥綜合癥等多種疾病的病理生理過程發(fā)揮著重要作用。同時研究發(fā)現(xiàn)Aqps在與血管通透性相關疾病也發(fā)揮作用。Aqps是否參與膿毒癥肺血管通透性的調節(jié)及哪種Aqp在其中起主要作用目前不清楚。
　　據(jù)此，本課題采用大鼠盲腸結扎穿孔復制膿毒癥模型，研究(1)Aqp3在膿毒癥肺血管通

3、透性的作用;(2)Aqp3對膿毒癥肺血管通透性的調節(jié)機制;(3)SS-31通過Aqp3對膿毒癥肺血管通透性的保護作用。
　　方法:
　　采用盲腸結扎穿孔復制膿毒癥模型，提取大鼠原代肺靜脈內皮細胞;提取肺靜脈和內皮細胞RNA和總蛋白;使用PCR的方法檢測肺靜脈中Aqp3的表達變化;使用蛋白免疫印跡檢測肺靜脈和內皮細胞Aqp3、Cav-1、Occludin蛋白變化;異硫氰酸熒光素標記的熒光白蛋白透過來檢測肺血管及內皮細胞的通透性

4、;ROS試劑盒測肺靜脈和內皮細胞ROS變化;使用小RNA對Aqp3的表達進行干擾。
　　內容:
　　第一部分 Aqp3在膿毒癥肺血管通透性的作用
　　1.采用大鼠盲腸結扎穿孔復制膿毒癥模型，取正常和膿毒癥大鼠肺靜脈，提取各組肺靜脈組織RNA，測各種水通道蛋白RNA的表達變化。在動物水平通過多批次實驗證明，Aqp的12個亞型在膿毒癥肺血管的表達大多增強，其中Aqp3的增強趨勢更明顯。因此猜測Aqp3在膿毒癥肺血管通透性中

5、起重要作用。
　　2.在動物水平，采用大鼠盲腸結扎穿孔復制膿毒癥模型，測膿毒癥6h和膿毒癥12h和假手術組大鼠肺血管通透性變化，同時提取各組大鼠肺靜脈，檢測肺靜脈中Aqp3的表達變化，初步了解膿毒癥大鼠肺血管通透性的變化和Aqp3表達變化的關系。在細胞水平，提取原代肺靜脈內皮細胞，使用LPS(1μg/ml)分別作用肺靜脈內皮細胞6h和12h，觀察LPS刺激后的內皮細胞通透性變化和Aqp3的表達變化，進一步了解LPS刺激肺靜脈內皮細

6、胞后通透性變化和內皮細胞Aqp3表達變化的關系。另外，在細胞水平，提取原代內皮細胞，采用小RNA干擾Aqp3，觀察LPS引起的肺靜脈內皮細胞通透性變化，明確Aqp3在膿毒癥肺血管通透性中的作用。
　　第二部分 Aqp3調節(jié)膿毒癥肺血管通透性的機制
　　在動物水平上，采用大鼠盲腸結扎穿孔復制膿毒癥模型，提取膿毒癥6h、12h組和假手術組大鼠肺靜脈，測肺靜脈中影響穿細胞途徑蛋白Cav-1和細胞旁途徑緊密連接蛋白Occludin的

7、表達變化。在細胞水平上，提取原代肺靜脈內皮細胞，使用LPS(1μg/ml)作用肺靜脈內皮細胞6h和12h，測LPS作用不同時間的肺靜脈內皮細胞Cav-1和Occludin的表達。同時，在細胞水平，提取原代內皮細胞，使用小RNA干擾Aqp3，測LPS作用的肺靜脈內皮細胞Cav-1和Occludin的表達。
　　第三部分 SS-31通過Aqp3對膿毒癥肺血管通透性的保護作用
　　在動物水平，采用盲腸結扎穿孔復制膿毒癥模型，在模型

8、結束后經(jīng)尾靜脈注射不同劑量的SS-31(0.5mg/kg，1mg/kg，3mg/kg)，觀察給藥后的肺血管通透性變化;另外，復制膿毒癥模型，模型結束后尾靜脈注射SS-31(3mg/kg)，對照組尾靜脈注射生理鹽水，取模型組和對照組大鼠肺靜脈，測Aqp3表達和ROS的變化，驗證SS-31通過調節(jié)Aqp3對膿毒癥肺血管通透性的保護作用。在細胞水平，提取原代肺靜脈內皮細胞，使用SS-31(0.1μg/ml)預處理細胞，觀察LPS(1μg/ml

9、)作用后測內皮細胞通透性和Aqp3的表達及ROS的變化，驗證SS-31通過Aqp3對LPS刺激的肺靜脈內皮細胞的保護作用。
　　結果:
　　第一部分 Aqp3在膿毒癥肺血管通透性作用
　　1.膿毒癥大鼠肺靜脈中多種Aqps的RNA表達增強，包括Aqp1，3，4，7，11，12，其中Aqp3增強趨勢最明顯。在動物水平隨著膿毒癥時間的延長肺血管通透性和Aqp3的表達增強越明顯，膿毒癥6h和12h組較假手術組肺血管通透性和A

10、qp3的蛋白表達明顯升高，Aqp3的表達和通透性的變化一致;在細胞水平LPS刺激6h和12h肺靜脈內皮細胞通透性顯著增加，Aqp3的蛋白表達也明顯升高。
　　2.在細胞水平干擾Aqp3能有效拮抗LPS刺激引起的內皮細胞通透性升高。
　　第二部分 Aqp3在膿毒癥肺血管通透性機制
　　1.膿毒癥后影響跨細胞途徑蛋白Cav-1表達增強，細胞旁途徑緊密連接蛋白Occludin的表達減弱。LPS刺激后肺靜脈內皮細胞Cav-1表

11、達增強，Occludin的表達減弱，與動物水平上變化一致。
　　2.細胞水平上干擾Aqp3后能拮抗LPS刺激肺靜脈內皮細胞Cav-1增強和Occludin的減弱。
　　第三部分 SS-31通過Aqp3對膿毒癥肺血管通透性的保護作用
　　1.膿毒癥后大鼠肺靜脈ROS表達增加，SS-31預處理能拮抗膿毒癥ROS的增加;同時SS-31預處理膿毒癥大鼠能拮抗膿毒癥肺血管通透性的增加和Aqp3表達增強。
　　2.LPS刺激

12、后肺靜脈內皮細胞ROS表達增加，SS-31預處理拮抗LPS刺激引起的內皮細胞ROS的升高;同時SS-31預處理LPS刺激的肺靜脈內皮細胞能拮抗內皮細胞通透性和Aqp3表達的增強，與動物水平一致。
　　3.SS-31預處理后能改善膿毒癥大鼠存活率和存活時間。
　　結論:
　　1.Aqp3對膿毒癥肺血管通透性起調節(jié)作用;
　　2.Aqp3參與膿毒癥肺血管通透性的調節(jié)可能通過穿細胞和跨細胞途徑;
　　3.SS-3