Rho激酶對(duì)休克血管反應(yīng)性的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制.pdf

1、嚴(yán)重創(chuàng)傷/休克失代償期常出現(xiàn)血管的低反應(yīng)性，它表現(xiàn)為全身血管對(duì)縮血管物質(zhì)和舒血管物質(zhì)的反應(yīng)降低或不反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)血管低反應(yīng)性的發(fā)生與腎上腺素能受體失敏、一氧化氮(nitricoxide，NO)水平增高、血管平滑肌細(xì)胞(vascularsmoothmusclecell，VSMC)鉀、鈣通道功能失常及細(xì)胞膜超極化有關(guān)，同時(shí)本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)在大鼠失血性休克2h后，VSMC存在鈣失敏，鈣失敏在休克血管低反應(yīng)性的發(fā)生中起重要作用。關(guān)于失血性休

2、克后VSMC鈣敏感性變化的調(diào)節(jié)機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)與Rho激酶、蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)、蛋白激酶G(proteinkinaseG，PKG)有密切關(guān)系，但具體的調(diào)節(jié)機(jī)制及由哪一種分子起主要作用，目前尚不清楚。Rho激酶是小G蛋白R(shí)ho的下游蛋白，與VSMC鈣敏感性調(diào)節(jié)密切相關(guān)，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)Rho激酶參與許多與VSMC鈣敏感性有關(guān)疾病的發(fā)生過程，如在高血壓、動(dòng)脈硬化以及冠脈痙攣發(fā)生過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。

3、為探討Rho激酶對(duì)失血性休克血管反應(yīng)的調(diào)控作用，Rho激酶是否通過調(diào)節(jié)失血性休克后鈣敏感性來調(diào)節(jié)血管反應(yīng)性，以及Rho激酶調(diào)節(jié)失血性休克血管反應(yīng)性和鈣敏感性的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用大鼠失血性休克模型，分別從離體血管環(huán)水平，VSMC水平以及整體動(dòng)物水平研究了Rho激酶在休克后血管反應(yīng)性中的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制，具體內(nèi)容包括三部分，分為：(1)Rho激酶在調(diào)節(jié)休克動(dòng)物血管反應(yīng)性和鈣敏感性中的作用；(2)Rho激酶調(diào)節(jié)休克動(dòng)物血管反應(yīng)性和鈣敏感性的機(jī)制

4、；(3)初步了解Rho激酶可否作為恢復(fù)失血性休克大鼠血管反應(yīng)性的靶點(diǎn)。 主要實(shí)驗(yàn)方法： 第一部分觀察了Rho激酶在調(diào)節(jié)失血性休克大鼠血管反應(yīng)性和鈣敏感性中的作用，包括：離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)，取失血性休克大鼠腸系膜上動(dòng)脈(superiormesentericartery，SMA)，利用離體血管環(huán)測(cè)定技術(shù)，觀察休克后不同時(shí)相點(diǎn)(休克即刻，休克30min，休克1h，休克2h)SMA血管反應(yīng)性(血管環(huán)對(duì)梯度濃度去甲腎上腺素(norep

5、inephrine，NE)的收縮反應(yīng)性)和鈣敏感性(血管環(huán)在120mmol/LK+去極化狀態(tài)下，對(duì)梯度濃度Ca2+的反應(yīng)性)，同時(shí)取腸系膜動(dòng)脈測(cè)定休克后各時(shí)相點(diǎn)Rho激酶活性，分析血管反應(yīng)性、鈣敏感性與Rho激酶活性之間的關(guān)系。觀察Rho激酶活性調(diào)節(jié)劑血管緊張素Ⅱ(angiotensin-Ⅱ，Ang-Ⅱ)，Insulin對(duì)血管反應(yīng)性和鈣敏感性的影響；VSMC實(shí)驗(yàn)，取腸系膜動(dòng)脈，采用酶消化法獲取原代VSMC，觀察缺氧不同時(shí)間后(缺氧10m

6、in，30min，60min，90min，120min)VSMC對(duì)NE收縮反應(yīng)的變化，同時(shí)觀察Rho激酶激動(dòng)劑Ang-Ⅱ和抑制劑Y-27632對(duì)VSMC收縮反應(yīng)性的影響。 第二部分，研究Rho激酶調(diào)節(jié)休克動(dòng)物血管反應(yīng)性和鈣敏感的機(jī)制，包括：離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)，取失血性休克2h大鼠SMA，觀察肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosinlightchainphosphatase，MLCP)抑制劑(CalyculinA)、肌球蛋白輕鏈激酶(myos

7、inlightchainkinase，MLCK)抑制劑(ML-9)對(duì)Rho激酶激動(dòng)劑引起的失血性休克大鼠SMA鈣增敏作用的影響；VSMC實(shí)驗(yàn)，觀察Rho激酶活性調(diào)節(jié)劑對(duì)缺氧VSMC的MLCP、MLCK活性以及肌球蛋白輕鏈(20kDamyosinlightchain，MLC20)磷酸化水平的影響，研究MLCP、MLCK和MLC20磷酸化在Rho激酶調(diào)節(jié)鈣敏感性中的作用。 第三部分，研究Rho激酶可否作為恢復(fù)血管反應(yīng)性的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)，采

8、用整體動(dòng)物，觀察Rho激酶活性調(diào)節(jié)劑對(duì)失血性休克后大鼠平均動(dòng)脈血壓(meanarterialpressure，MAP)、腸系膜上動(dòng)脈血管管徑對(duì)NE收縮反應(yīng)性的影響。 主要研究結(jié)果： 1.休克早期(休克即刻、休克30min)，SMA對(duì)NE的反應(yīng)性和鈣敏感性明顯升高，最大收縮力(maximalcontraction，Emax)明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)；隨著休克時(shí)間的延長(zhǎng)，血管環(huán)對(duì)NE反應(yīng)性和鈣敏感性逐漸下降，在

9、休克晚期(休克1h和休克2h)，血管環(huán)對(duì)NE反應(yīng)性和鈣敏感性明顯降低，Emax明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)。與正常對(duì)照組相比，Rho激酶活性在休克即刻明顯升高(P＜0.05)，隨著休克時(shí)間延長(zhǎng)，Rho激酶活性逐漸下降，在休克1及2h，Rho激酶活性明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)。SMA對(duì)NE反應(yīng)性與Rho激酶活性變化之間呈直線正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.9861(P＜0.05)；SMA對(duì)鈣的敏感性與Rho激酶活性變化之間呈

10、直線正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.9704(P＜0.05)。Rho激酶活性抑制劑Insulin(10-7mol/L)可明顯降低休克即刻SMA血管環(huán)對(duì)NE的反應(yīng)性和鈣敏感性(P＜0.05或P＜0.01)。Rho激酶激動(dòng)劑Ang-Ⅱ(10-9mol/L)可明顯升高休克2h血管環(huán)對(duì)NE反應(yīng)性和鈣敏感性(P＜0.05或P＜0.01)，Emax明顯升高(P＜0.01)，而Rho激酶特異性抑制劑Y-27632(10-5mol/L)可拮抗由Ang-Ⅱ引起的

11、休克2h血管環(huán)對(duì)NE反應(yīng)性和鈣敏感性的增高。 2.VSMC在缺氧10min時(shí)對(duì)NE收縮反應(yīng)性與正常對(duì)照組相比有所升高，隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，VSMC對(duì)NE的收縮反應(yīng)逐漸下降，在缺氧60min、90min和120min時(shí)，VSMC對(duì)NE的收縮反應(yīng)性顯著低于正常對(duì)照組(P＜0.05或P＜0.01)。Rho激酶激動(dòng)劑Ang-Ⅱ(10-9mol/L)可明顯升高缺氧90minVSMC對(duì)NE的收縮反應(yīng)性(P＜0.05)，而Rho激酶特異性抑制

12、劑Y-27632(10-5mol/L)可拮抗由Ang-Ⅱ引起的缺氧VSMC收縮反應(yīng)性的升高。 3.MLCP抑制劑CalyculinA(10-7mol/L)可進(jìn)一步增加由Rho激酶激動(dòng)劑Ang-Ⅱ(10-9mol/L)引起的失血性休克SMA血管環(huán)鈣敏感性的升高，Emax明顯升高(P＜0.05)，而MLCK抑制劑ML-9(10-7mol/L)對(duì)Rho激酶激動(dòng)劑Ang-Ⅱ(10-9mol/L)引起的SMA血管環(huán)鈣增敏無明顯的調(diào)節(jié)作用(

13、P＞0.05)。 4.VSMC缺氧90min后MLCP活性明顯升高，Rho激酶激動(dòng)劑Ang-Ⅱ(10-9mol/L)可降低缺氧引起的VSMCMLCP活性的升高(P＜0.01)，Rho激酶特異性抑制劑Y-27632(10-5mol/L)可拮抗由Ang-Ⅱ(10-9mol/L)引起的缺氧VSMCMLCP活性的降低。 5.VSMC缺氧90min后MLCK活性明顯降低，Rho激酶激動(dòng)劑Ang-Ⅱ(10-9mol/L)和抑制劑Y-

14、27632(10-5mol/L)對(duì)缺氧后VSMCMLCK活性無明顯調(diào)節(jié)作用。 6.MLC20磷酸化表達(dá)水平在VSMC缺氧90min后明顯降低(P＜0.01)，Rho激酶激動(dòng)劑Ang-Ⅱ(10-9mol/L)可升高缺氧后VSMCMLC20磷酸化表達(dá)水平，Y-27632(10-5mol/L)可拮抗由Ang-Ⅱ引起的MLC20磷酸化水平的升高。 7.失血性休克后大鼠對(duì)NE的升壓反應(yīng)和腸系膜上動(dòng)脈對(duì)NE的收縮反應(yīng)明顯降低(P＜0

15、.05或P＜0.01)，Rho激酶激動(dòng)劑精氨酸血管加壓素(argininevasopressin,AVP)(0.4U/kg)可增加失血性休克大鼠對(duì)NE的升壓反應(yīng)和腸系膜上動(dòng)脈對(duì)NE的收縮反應(yīng)(P＜0.05或P＜0.01)，Y-27632(3μg/100g)可拮抗由AVP引起NE的升壓反應(yīng)和腸系膜上動(dòng)脈對(duì)NE收縮反應(yīng)的升高。 結(jié)論： 1.失血性休克后大鼠血管反應(yīng)性和鈣敏感性呈雙相變化，Rho激酶可通過調(diào)節(jié)血管平滑肌的鈣敏感

16、性來調(diào)節(jié)血管的反應(yīng)性，Rho激酶在失血性休克大鼠血管反應(yīng)性的雙相變化中具有重要的調(diào)節(jié)作用。 2.Rho激酶可通過調(diào)節(jié)MLCP的活性和MLC20磷酸化水平來調(diào)節(jié)失血性休克動(dòng)物血管的反應(yīng)性。休克早期，由于Rho激酶活性升高，MLCP活性降低，MLC20磷酸化水平升高，血管反應(yīng)性升高；在休克晚期，Rho激酶活性降低，MLCP活性升高，MLC20磷酸化水平降低，血管反應(yīng)性降低。MLCK在Rho激酶調(diào)節(jié)VSMC鈣敏感性變化中無明顯作用。