卡介苗(BCG)對(duì)人NK細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的： 卡介苗(bacillus Calmette—Guerin，BCG)是一種活的減毒牛型結(jié)核分支桿菌疫苗，除應(yīng)用于結(jié)核病的預(yù)防接種外，還可以作為一種非特異性及特異性的細(xì)胞免疫增強(qiáng)劑應(yīng)用于腫瘤的治療，并且取得了公認(rèn)的顯著療效，但是其抗腫瘤的確切機(jī)制并不完全清楚。迄今為止，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道主要集中在對(duì)BCG本身及其作用于T淋巴細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等的研究，而BCG對(duì)自然殺傷細(xì)胞(nature killer cell，NK)

2、的作用仍不清楚。NK細(xì)胞是固有免疫的重要組成成分，能夠殺傷病毒感染的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，并且具有免疫調(diào)節(jié)功能。本課題擬研究BCG對(duì)人NK細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制，為探討B(tài)CG抗腫瘤機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究對(duì)象和方法： 1.研究對(duì)象：志愿者43例，其中男23例，女20例，年齡范圍21-43歲，平均年齡30.3歲，均為抗結(jié)核抗體陰性。本課題已取得所有志愿者知情同意，并簽署正式的知情同意書。 2.方法：無菌抽取外周

3、靜脈血10-20mL，肝素(15～25U/mL血)抗凝。用Ficoll進(jìn)行密度梯度離心，獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)。 2.1將PBMC不加或加BCG培養(yǎng)，利用ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)上清液IFN—γ、TNF—α含量；利用ELISpot方法在單個(gè)細(xì)胞水平上檢測(cè)IFN—γ、顆粒酶B產(chǎn)生細(xì)胞的頻率；以K562為靶細(xì)胞，利用四甲基偶氮唑鹽比色法(monotetra

4、zolium test，MTT)測(cè)定PBMC殺傷功能。 2.2利用免疫磁珠法純化NK細(xì)胞。將PBMC和NK細(xì)胞不加或加BCG、IL-12、PMA+Ionomycin培養(yǎng)，利用ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)上清液IFN—γ、TNF—α含量；以K562為靶細(xì)胞，利用MTT法測(cè)定NK細(xì)胞殺傷功能。 2.3將PBMC不加或加不同濃度BCG培養(yǎng)，利用ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)上清液IL-12p40含量；利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK細(xì)胞IL-12Rβ

5、1的表達(dá)。觀察抗IL-12受體β1 mAb(2B10)對(duì)BCG作用于PBMC產(chǎn)生IFN—γ及分泌顆粒酶B的影響。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。 結(jié)果： 1.BCG呈劑量依賴的方式誘導(dǎo)PBMC產(chǎn)生IFN—γ和TNF—α。 2.BCG刺激條件下PBMC顆粒酶B分泌細(xì)胞數(shù)明顯高于不加任何刺激劑組(P<0.05)。BCG增強(qiáng)正常人PBM

6、C殺傷K562細(xì)胞的活性，并且隨著效靶比的增高而增強(qiáng)。BCG濃度為0.2μg/ml時(shí)即可促進(jìn)PBMC的殺傷功能，2μg/ml時(shí)作用最顯著，20μg/ml時(shí)促進(jìn)作用下降。 3.BCG不能誘導(dǎo)純化NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN—γ，但與IL-12同時(shí)刺激則表現(xiàn)出協(xié)同作用。純化NK細(xì)胞在不加任何刺激劑及BCG、IL-12和BCG+IL-12分別刺激等四種條件下均不產(chǎn)生TNF—α。 4.純化NK細(xì)胞經(jīng)BCG刺激后殺傷K562的活性略高于未刺

7、激的NK細(xì)胞，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 5.BCG呈劑量依賴方式誘導(dǎo)PBMC產(chǎn)生IL-12、并促進(jìn)NK細(xì)胞不同亞群表達(dá)IL-12Rβ1。 6.在BCG中加入抗IL-12受體β1 mAb(2B10)后，PBMC分泌IFN—γ明顯低于單獨(dú)BCG刺激組(P<0.001)，但仍高于不加任何刺激劑組(P<0.01)；PBMC分泌顆粒酶B細(xì)胞數(shù)明顯減少(與單獨(dú)BCG刺激組相比，P<0.05)。 結(jié)論： 1

8、.BCG誘導(dǎo)抗結(jié)核抗體陰性正常人PBMC產(chǎn)生IFN—γ和TNF—α。當(dāng)BCG和IL-12共同刺激時(shí)表現(xiàn)為協(xié)同作用。BCG促進(jìn)正常人PBMC顆粒酶B分泌細(xì)胞數(shù)增加，增強(qiáng)PBMC殺傷K562細(xì)胞的活性。 2.BCG單獨(dú)刺激不能誘導(dǎo)正常人純化NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN—γ和TNF—α，但能顯著增加IL-12誘導(dǎo)NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN—γ。BCG不能增強(qiáng)純化NK細(xì)胞殺傷K562的活性。 3.對(duì)BCG作用于正常人NK細(xì)胞機(jī)制的研究表明，BCG