黃芪多糖對尿路細胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用研究.pdf

1、目的：尿路感染(Urinary tract infection， UTI)是臨床常見的感染性疾病之一，女性較為多見。其已成為慢性腎功能不全的主要病因。然而，近年來由于抗生素耐藥的逐年增加，感染菌在尿路細胞內(nèi)的長期定居以及機體尿路免疫失衡等原因嚴重影響了單一抗生素治療的效果，臨床治療出現(xiàn)了困境，也增加了患者的身心痛苦。因此，尋找并開發(fā)抗生素以外的治療方案，是應對UTI的新策略。
　　 尿路固有免疫是機體預防病原菌侵入的重要屏障，起

2、著抵抗微生物的防御作用。TLR4在尿路細胞固有性免疫中扮演重要角色，其在尿路主要表達于膀胱上皮細胞和腎小管上皮細胞。TLR4與其配體結(jié)合后，可以通過MyD88依賴或cAMP/CREB信號轉(zhuǎn)導途徑，活化尿路細胞，調(diào)節(jié)多種細胞因子的表達，發(fā)揮抵抗細菌入侵，促進細菌排出等固有性免疫作用。
　　 前期的臨床調(diào)查研究已發(fā)現(xiàn)中藥黃芪能夠通過上調(diào)慢性尿路感染患者TLR4的表達提高機體的免疫能力，提高治療效果。而黃芪是多種化學成分的混合物，黃芪

3、多糖(Astragalus polysaccharides， APS)作為黃芪的主要成分，也是TLR4的配體，其是否能夠通過TLR4調(diào)節(jié)尿路粘膜免疫功能的研究還鮮有報道。
　　 本研究旨在將黃芪多糖作用于膀胱上皮細胞株5637細胞、腎小管上皮細胞株A498、人單核細胞型淋巴瘤THP-1細胞及小鼠后，探索黃芪多糖對尿路細胞TLR4表達、細胞因子的分泌、抗菌效應、與LPS的競爭作用以及小鼠膀胱炎癥反應強度的影響，進一步研究黃芪多糖調(diào)

4、節(jié)尿路粘膜免疫功能的機制，為尿路感染的免疫調(diào)節(jié)、治療提供實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.TLR4表達的檢測：將不同濃度的黃芪多糖及黃芪多糖與LPS的混合物分別與5637細胞、A498細胞、THP-1細胞共培養(yǎng)48小時，收集細胞，流式細胞儀檢測細胞表面TLR4的表達；
　　 2.5637細胞的抗侵襲作用：不同濃度的黃芪多糖及黃芪多糖與LPS的混合物刺激5637細胞48小時后，加入大腸桿菌U30共培養(yǎng)1小時，徹底

5、洗去未侵入細胞的大腸桿菌，將侵入細菌的細胞用0.5％的TritonX-100溶解，溶解液稀釋后LB平板培養(yǎng)過夜，進行菌落計數(shù)；
　　 3.實時定量PCR檢測細胞因子的表達：黃芪多糖作用于5637細胞、A498細胞、THP-1細胞，以及感染模型小鼠膀胱和腎組織，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，實時定量PCR測定IL-6、IL-8、TNF-α、MyD88的mRNA表達。
　　 4.動物實驗：8周齡Balb/C雌鼠隨機分為2組

6、，對照組和實驗組，每組15只。大腸桿菌U30株經(jīng)LB液體培養(yǎng)基48小時靜置培養(yǎng)，生理鹽水洗滌，以每只108CFU/50μl的菌量，經(jīng)小鼠尿道注入膀胱。感染6小時后，對照組，腹腔注射生理鹽水，100μl/只；實驗組，腹腔注射黃芪多糖注射液，每只200mg/kg，每天一次，共注射3天。
　　 5.膀胱內(nèi)細菌的菌落計數(shù)：處死小鼠，將膀胱剪碎后用TritonX-100溶解，溶解液稀釋后涂布于固體LB平板培養(yǎng)基，37℃溫箱孵育過夜，進行菌

7、落計數(shù)。
　　 6.制作感染小鼠膀胱、腎組織切片，HE染色，光學顯微鏡觀察炎癥細胞浸潤現(xiàn)象。
　　 結(jié)果：
　　 1.黃芪多糖作用于5637、A498和THP-1細胞48小時后，三種細胞表面TLR4表達均有顯著增加。不同濃度的APS作用于5637細胞后，與對照組相比，均能刺激TLR4表達增加(P＜0.05)，但不同濃度間沒有顯著差異(p＞0.05)；黃芪多糖與LPS混合后，仍可刺激TLR4表達增加(P＜0.05)

8、，與APS單獨刺激相比有顯著差異(P＜0.05)，而與LPS單獨刺激相比無顯著差異(p＞0.05)。APS以100μg/ml的濃度作用A498和THP-1細胞48小時后，與對照組相比，也能顯著刺激兩種細胞TLR4表達上調(diào)(P＜0.05)。
　　 2.5637細胞抗侵襲實驗顯示：APS以20μg/ml、100μg/ml作用于5637細胞48小時后，U30細菌感染細胞，細胞內(nèi)侵入的細菌數(shù)分別為70.45±15.5，82.73±38.

9、25，顯著低于空白對照組234.9±115，(P＜0.05)，不同濃度的APS與2μg/ml LPS共同作用5637細胞，細胞內(nèi)細菌數(shù)也顯著低于對照組，且隨著APS濃度增高(20、100、500μg/ml)，細胞內(nèi)細菌數(shù)呈下降趨勢。
　　 3.Real-time PCR檢測顯示，5637細胞經(jīng)100μg/ml的APS刺激后，IL-6和IL-8mRNA表達均明顯低于空白對照組(P＜0.05); LPS與不同濃度的APS共同作用56

10、37細胞，與對照組相比，IL-6、IL-8mRNA表達也顯著降低(P＜0.05)，但不同APS濃度組間比較無顯著差異。A498細胞經(jīng)100μg/mlAPS刺激后，IL-6和IL-8mRNA表達量比空白對照組明顯降低(P＜0.05)，而THP-1細胞經(jīng)100μg/mlAPS刺激后，IL-6、TNF-α、MyD88與空白對照組相比，顯著升高(P＜0.05)。
　　 4.大腸桿菌感染小鼠，膀胱和腎臟經(jīng)Real-time PCR檢測，A

11、PS治療組IL-6mRNA的相對表達與空白對照組比較無明顯差異(P＞0.05)；而TNF-α表達量與空白對照組比較有所上升(P＜0.05)。
　　 5.小鼠膀胱內(nèi)感染的菌落計數(shù)顯示，注射APS的小鼠膀胱內(nèi)細菌數(shù)明顯低于生理鹽水對照組(P＜0.05)，其數(shù)值分別為APS組56.67±20.81，生理鹽水對照組140±52.92。
　　 6.感染小鼠膀胱組織經(jīng)HE染色顯示，注射APS組小鼠膀胱組織與對照組相比，炎細胞浸潤顯著

12、低于對照組膀胱，粘膜層較平滑、完整。
　　 結(jié)論：
　　 1.黃芪多糖能明顯促進5637細胞、A498細胞和THP-1細胞表面TLR4的表達，各濃度之間無顯著差別。
　　 2.黃芪多糖可顯著增強5637細胞抵抗U30侵襲的能力，且在LPS濃度不變的情況下，抗侵襲能力隨著APS濃度的提高而增加。
　　 3.黃芪多糖可明顯降低5637細胞和A498細胞IL-6、IL-8mRNA的表達。但可促進THP-1細胞I